目的  基于网络药理学技术和体外细胞实验探究盐酸药根碱（jatrorrhizine hydrochloride, JH）治疗酒精性肝炎（alcoholic hepatitis, AH）的作用机制，为后续研究提供参考。

方法  基于PubMed数据库查询JH药物成分，借助SWISS数据库预测药物作用目标，在GeneCards和OMIM数据库中找出AH的目标点。通过DAVID数据库实现基因本体（gene ontology, GO）分析和京都基因与基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes, KEGG）富集分析，利用STRING数据库和Cytoscape软件建立蛋白质互作网络（protein-protein interaction network, PPI），并通过体外细胞实验验证。利用脂多糖（lipopolysaccharide, LPS）诱导RAW264.7细胞构建体外炎症模型，将细胞分为五组，采用MTT法测定不同浓度JH对细胞活性的作用，采用酶联免疫吸附测定法（enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA）测定JH对肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α, TNF-α）、白细胞介素-6（interleukin-6, IL-6）等炎症因子产生和释放的影响。

结果  利用网络药理学分析得到25个JH与AH的关键靶点，结合GO和KEGG富集分析及PPI网络构建结果，确定ESRI、NT5E、PGR等基因为后续实验靶点。根据ELISA实验结果进一步证实，相较于对照组，LPS组RAW264.7的M1型巨噬细胞中与炎症相关的因子TNF-α和IL-6的分泌显著增加；相较于LPS组，含有JH的组别细胞上清液中炎症因子TNF-α和IL-6的分泌有降低的趋势，尤其是随着JH浓度增加，其降低效果更加显著。

结论  在炎症模型细胞中，JH可以调控M1极化，表明JH可能是治疗AH的潜在分子。

酒精性肝炎（alcoholic hepatitis, AH）是酒精性肝病的一种分支，主要表现为黄疸和不断加重的炎症肝损伤[1]。AH病程长且易复发，可能诱发各种复杂症状，酒精依赖度高的AH患者生活质量和健康状况将大大下降。长期大量饮酒可导致严重肝损伤，并逐渐发展为AH[2]。我国尚缺乏全国性酒精性肝病的流行病学资料，但地区性流行病学调查结果显示，近年来我国饮酒人群比例和酒精性肝病患病率均呈上升趋势，一般人群酒精性肝病患病率为15%~20%。AH已成为我国最主要的慢性肝病之一，极大地威胁肝脏健康，若患者未得到及时治疗，可能转变为肝纤维化、肝硬化，甚至肝癌[3]。烟草、病毒感染、遗传因素等也是AH的主要诱因[4]。AH的发展进程与氧化应激密切相关，肝细胞内环境的氧化平衡遭到破坏，导致氧化应激信号分子混乱，从而引发肝脏脂肪积累，变异的脂毒素刺激氧化应激，对肝细胞形成二次打击[5]。酒精在肝脏内能被氧化为乙醛，进一步激活肝脏星状细胞，从而对肝细胞产生毒性[6]。酒精摄入也可能破坏肝细胞内钙平衡，诱发内质网应激，加速肝脏氧化应激损伤和炎症反应。

盐酸药根碱（jatrorrhizine hydrochloride, JH），又名药根碱盐酸盐，为复方二妙颗粒中黄柏的主要组成元素之一[7]。研究表明，JH具有抗炎、抗菌、降血糖、保护神经、抗心律失常及调节脂肪细胞糖脂代谢等作用[8-12]。目前临床实践尚未找到AH有效的治疗方法，其发病原因复杂且不断变化，很大程度上妨碍了新药研制工作[13]。因此，寻找并研究能有效治疗AH的药物，以延缓或阻止肝硬化和肝癌等肝病的发展具有重要意义。JH对AH的预防效果尚未明确，网络药理学通过研究生物分子网络的结构和功能来理解中药的药效，并将网络生物学的观念和方法应用于中药药理学的研究，这为深入研究JH是否能对AH产生疗效及其机制原理提供了新视角[14-15]。本研究基于网络药理学和体外细胞实验，探讨JH对AH的关键靶点及其可能的作用机制，以期为AH的治疗提供新的研究路径及参考。

1 资料与方法

1.1 网络药理预测及分子对接

1.1.1 JH靶点筛选

以“jatrorrhizine hydrochloride”为关键词，通过PubMed数据库（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）查找该药物成分，通过SWISS数据库（http://www.swisstargetprediction.ch/）查找JH靶点。每个目标蛋白的名字均已通过UniProt数据库校验并得到了JH可能的目标名称。

1.1.2 AH靶点筛选

以“Alcoholic Hepatitis”为关键词，在GeneCards数据库（https://www.genecards.org）和OMIM数据库（http://www.omim.org）中查找AH相关靶点。根据GeneCards数据库，靶点与病症间的紧密度与Relevance score值呈正比，筛选与整合OMIM数据库的靶点后剔除重复项，获取AH的作用靶点，接着将这些靶点与JH关联靶点进行交集，并通过韦恩图加以呈现，从而找出JH治疗AH的关键靶点。

1.1.3 JH靶点网络及蛋白质互作网络构建与拓扑学分析

借助STRING数据库设立药物与疾病之间共享靶点蛋白质的交互关系，利用Cytoscape 3.9.0软件构建蛋白质互作网络（protein-protein interaction network, PPI），线的密集程度代表其影响深远程度，然后对其进行拓扑分析，并计算度数、紧邻中心度和中介中心度作为过滤标准，通过这些标准筛选出关键目标，对其按照数值高低进行排列，数值越高，越能突显该目标的关键性。

1.1.4 GO功能富集与KEGG通路富集分析

利用DAVID平台（https://david.ncifcrf.gov/）以输入的JH和AH的交互作用为靶点，进行基因本体（gene ontology, GO）功能分析以研究JH和AH相互影响的基因靶点，分析涵盖生物过程（biological process, BP）、分子功能（molecular function, MF）及细胞组成（cellular component, CC）。利用P＜0.05的判别规则，挑选排名前十的项目绘制柱状图。同时进行京都基因和基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes, KEGG）路径富集分析，以P＜0.05作为富集显著性的筛选条件，确定JH治疗AH的主导路径。最后，按照P＜0.05的准则，选取前20个信号路径制作气泡图。

1.1.5 JH与关键作用靶点分子对接

选择PDB数据库（https://www.rcsb.org）中的关键活性成分及主导的目标分子进行对接。利用AutoDock Vina 1.5.6软件进行JH与主要作用对象的分子对接，优化最低的结合能力方式进行下一步分析。利用Autodocking软件执行分子对接操作，运用PyMOL软件解读分子对接结果，并进行可视化展示和处理。

1.2 细胞实验材料及验证方法

1.2.1 细胞和试剂

小鼠单核巨噬细胞RAW264.7由湖北科技学院公共平台赠送，JH（纯度不低于98%）购自上海源叶公司，不低于97%纯度的脂多糖（lipopolysaccharide, LPS）购自美国Sigma-Aldrich公司，小鼠TNF-α和IL-6 ELISA试剂盒购自上海酶联公司，DMEM和胎牛血清购自美国Gibco公司。

1.2.2 细胞培养

将RAW264.7巨噬细胞在37℃、5%的CO₂环境下，利用含有10%的胎牛血清和1%双抗的高糖DMEM培养液进行培育。

1.2.3 JH对RAW264.7细胞活力的影响

将RAW264.7细胞按每孔8 000个细胞的密度分布在96孔板上，并让其在4 h内附着在孔壁。随后，注入浓度为0、5、25、50、75和100 μM的JH于RAW264.7细胞，并持续处理24 h。然后，在DMEM培养液中混入MTT试剂，并将其置于37℃的细胞孵化箱中孵化4 h。接下来，采用MTT检测法检测24 h处理后JH对RAW264.7细胞增殖的影响，并在450 nm的光波下使用酶标仪测定光密度（optical density, OD）。

1.2.4 体外炎症模型建立

将LPS粉末用配置好的DMEM配成1 mM的LPS母液，随后加入培养基，浓度稀释为20 μM，将含有LPS的培养基加入至细胞培养皿中培养24 h，诱导RAW264.7细胞向M1型巨噬细胞转化。

1.2.5 细胞分组与处理

选取发育良好的RAW264.7细胞进行分组，包括基础对照组、实验模型组（LPS组）和JH低度、中度、高度浓度组。其中对照组不给药，LPS组按1.2.4部分的方法处理，JH组先以LPS（20 μM）刺激24 h后，再分别给予50 μM（SK50）、75 μM（SK75）、100 μM（SK100）3种浓度的JH。

1.2.6 利用ELISA技术对RAW264.7细胞上清液中的TNF-α和IL-6的浓度进行测量

将密度为每孔有8 000个RAW264.7细胞栽培于96孔板上，让细胞附壁的过程持续4 h后，按照1.2.5部分的步骤对RAW264.7细胞施加药品处理，每组均有3个重复的孔。完成处理后，收集每组细胞的上层溶液，并依照ELISA试剂盒的使用方法测定上层溶液中的TNF-α和IL-6浓度。

1.3 统计学方法

采用Image J和Graphpad Prism 8.0软件处理和分析数据，实验共执行3次，并对各组数据进行t检验。以P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 JH抗AH作用靶点

如图1所示，将筛选出的71个JH作用靶点和6 410个AH靶点通过韦恩图取交集，获得28个共同交集靶点，共呈现56条边，30个节点，见图2。

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  图1 JH与AH靶点交集韦恩图

  Figure 1.Venn diagram of intersection of targets between JH and AH

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  图2 JH抗AH的靶点网络

  Figure 2.Target network of JH against AH

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2.2 共同靶点PPI网络

JH抗AH的PPI网络见图3，包含25个节点和56条边，PPI网络中度值排名前25位的靶点见图4。在度值＞2、紧邻中心度＞0.005和中介中心度＞0.003的基础上选取核心目标构建网络，借助网络拓扑进行分析，找出了25个关键目标，见表1。排名前10位的基因按MCC算法评分由高到低的顺序依次为ESR1、NT5E、PGR、PIK3CA、PDE4D、ATM、ITPR1、PDE5A、PRKDC和PDE4A。

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  图3 JH抗AH的PPI网络

  Figure 3.PPI network of JH against AH

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  图4 JH抗AH作用核心靶点网络

  Figure 4.Figure 4 The core target network of JH against AH

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  表格1 JH抗AH核心作用靶点的拓扑学参数

  Table 1.Topological parameters of the core target of JH against AH

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2.3 GO功能富集分析

图5展示了GO功能富集分析中前10个富集项目，这些目标点涉及多种BP，包含信号传递、反应缺氧、cAMP的代谢分解；同时也与细胞膜、质膜、胞质溶质、细胞核周边区域等CC有关；从MF角度看，它们包括了3,5,-环核苷酸磷酸二酯酶活性、3,5,-环腺苷酸磷酸二酯酶活性、磷酸腺肌醇-3-激酶等。

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  图5 JH抗AH的GO功能富集分析

  Figure 5.GO enrichment analysis of JH against AH

  注：黄色代表生物过程，蓝色代表细胞组成，绿色代表分子功能。

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2.4 KEGG通路富集分析

JH抗AH的KEGG路径富集分析结果见图6，根据P值大小排列，展示了最相关的前20个通路富集结果，cAMP信号通道（cAMP signaling pathway）、雌激素信号通道（estrogen signaling pathway）以及嘌呤代谢（purine metabolism）等路径富集状况较丰富。

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  图6 JH抗AH的KEGG通路富集分析

  Figure 6.KEGG pathway enrichment analysis of JH against AH

  注：点的体积指标志通路捕获的目标数量，颜色深浅对应 KEGG 的富集程度，颜色越深，代表其与JH对抗AH的作用关联更紧密。

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2.5 JH与核心靶点的分子对接分析

将JH与ESR1核心靶点的分子进行对接操作，结合能量低表示这个分子对接更稳定。结合能低于-5.0 kcal·mol^-1，说明配体与受体的自我结合有较强的亲和性。利用PyMOL软件可视化展示对接后的结果，见图7。

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  图7 JH与ESR1分子对接复合物成键信息三维图

  Figure 7.Three-dimensional diagram of bonding information between JH and ESR1 molecular docking complex

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2.6 细胞体外实验结果

2.6.1 JH对RAW264.7巨噬细胞活力的影响

在5~100 μM的浓度区间，JH对RAW264.7巨噬细胞无任何副作用。当浓度达到100、75和50 μM时，JH能刺激RAW264.7巨噬细胞生长。因此，本研究选择这三个浓度分别作为JH的高、中、低浓度参考值，见图8。

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  图8 JH对RAW264.7巨噬细胞增殖的影响

  Figure 8.Effect of JH on proliferation of RAW264.7 macrophages

  注：*与对照组比较，P＜0.05。

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2.6.2 JH对炎症模型细胞中炎症因子TNF-α、IL-6分泌的影响

与对照组相比，LPS组RAW264.7 M1型巨噬细胞关联的促炎细胞因子TNF-α和IL-6的分泌显著增加（P＜0.05），见图9。与LPS组相比，JH组细胞上清液中的TNF-α和IL-6促炎因子分泌均降低（P＜0.05）。随着JH浓度提高，JH组TNF-α和IL-6的分泌也逐渐降低（P＜0.05）。

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  图9 JH处理24 h对细胞上清中各炎症因子表达的影响

  Figure 9.Effect of JH treatment for 24 h on the expression of various inflammatory factors in the cell supernatant

  注：#与对照组比较，P＜0.05；*与LPS组比较，P＜0.05。

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3 讨论

随着我国经济社会的发展，人们的生活水平和饮食习惯有所改变，尤其是酒精消费量稳步升高，AH的发病数量也随之逐年增加，已成为肝脏疾病的主要死亡原因。深入探究AH的病因及防治方法对社会具有深远意义，应得到更为广泛的关注和重视[16]。

本研究首先基于TCMSP数据库筛选JH的成分靶点，再通过GO富集与KEGG通路分析，得到了25个JH治疗AH的关键靶点，说明JH可通过多个靶点发挥抗炎作用。对JH抗AH的核心基因进行了GO和KEGG富集分析，结果显示，这些关键基因主要关联了信号传输、缺氧反应、G蛋白偶联受体信号路径、3,5-环核苷酸磷酸二酯酶功能、3,5-环腺苷酸磷酸二酯酶功能等，主要影响的病理途径包括雌激素信号途径、嘌呤代谢和cAMP信号途径等。此外，本研究利用STRING数据库建立PPI网络中的相互作用目标，发现了与AH发病最密切相关的10个基因，分别为ESR1、NT5E、PGR、PIK3CA、PDE4D、ATM、ITPR1、PDE5A、PRKDC和PDE4A。

ESR1是一种关于AH疾病具有极高几率降低表达的基因，也是一种依赖配体的转录因子。它在肝脏内部结合雌激素及雌激素受体（尤指ESR1），能有效地缓解肝脏纤维化、延缓肝细胞死亡，同时抑制肿瘤细胞增长，这揭示了ESR1表达减少可能导致肝病的发生发展。窦橙云探讨了通过检测ESR1、DNMT3b和CDH1基因起始子的甲基化程度，早期乙型肝炎相关性肝癌中ESR1基因启动子甲基化情况是否能成为评估乙型肝炎肝衰竭患者短期28天生存现状的生物学指标的可能性[17]。

炎症反应的功能为触发并释放IL-6、TNF-α等炎症因子及细胞因子，LPS刺激巨噬细胞用于模仿人体在某一元素影响下产生的炎症反应。IL-6、TNF-α等炎症因子在炎症产生与发展的进程中起了重要作用[18-21]。研究证实，TNF-α是TNF家族中起主导作用的一种炎症传递物质，主要在脂肪细胞和（或）周围组织中形成，能激发活性氧产生和各类转录调节途径的相关机制，从而引起特定组织的炎症反应[22]。

体外实验证实，当JH浓度为50、75和100 μM时，可以促进RAW264.7巨噬细胞增殖。ELISA实验数据显示，与对照组相比，LPS组RAW264.7细胞M1型巨噬细胞相关炎性细胞因子TNF-α和IL-6的产生显著增多。然而，相对于LPS组，JH组细胞的上清液中炎症因子TNF-α和IL-6的产生明显降低，且随着JH浓度增高，其降低趋势更为明显。该结果初步表明，在炎症模型细胞中，JH可以调控M1极化，可能是治疗AH的潜在药物。

综上所述，本研究利用网络药理学探索JH的靶点，并发掘了治疗AH的潜在靶点，通过PPI网络获得了JH治疗AH的关键基因，为临床应用JH治疗AH提供了一定的参考。ESR1为治疗AH的潜在靶点，但本研究仅利用分子对接技术验证，后续可进一步通过蛋白印迹法、qPCR、敲低等生物学技术加以验证，并通过动物实验进一步探究JH治疗AH的作用机制。

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