目的  探究TBX2基因与头颈鳞癌（head and neck squamous cell carcinoma, HNSCC）的关系，分析甲基化预后的价值。

方法  综合利用UCSC Xena数据库、基因表达综合（Gene Expression Omnibus, GEO）数据库、人类蛋白质图谱（Human Protein Atlas, HPA）数据库、UALCAN数据库挖掘TBX2基因的表达、DNA甲基化和临床相关性，利用基因集富集分析（gene set enrichment analysis, GSEA）法富集TBX2在HNSCC中所参与的信号通路。

结果  TBX2基因在HNSCC中高表达，TBX2基因高、低表达组HNSCC患者的总生存率（overall survival, OS）无明显差异，但HNSCC中TBX2基因的表达与临床分级分期有关。TBX2基因某些cg位点的低甲基化水平与较差的OS和无进展生存期（progression free survival, PFS）密切相关。GSEA结果显示，TBX2基因主要参与钙信号通路、黏着斑、蛋白酶体等多条通路。

结论  TBX2基因可作为HNSCC特异性诊断和预后的生物标志物。

头颈鳞癌（head and neck squamous cell carcinoma, HNSCC）已在头部和颈部的各个区域检测到，诊断时存在远处转移，这与HNSCC的高死亡率相关[1]。已有较多研究表明，基因甲基化影响HNSCC的进展，如通过m7G修饰的METTL1、m6A修饰的RBM15及m5C调控基因会促进或抑制HNSCC细胞的侵袭、迁移和凋亡 [2]。在成熟体细胞组织中，DNA甲基化一般发生于CpG双核苷酸（cg位点）部位，促甲状腺激素释放激素基因cg01009664位点在健康细胞和口腔鳞状癌细胞之间的甲基化水平差异最大，但关于HNSCC其他亚类与cg位点的研究较少[3]。

TBX2是T-box家族成员之一，在多种癌症中过表达。其甲基化与缺血性脑卒中、非小细胞肺癌、横纹肌肉瘤等有密切联系，但较少有TBX2基因甲基化和HNSCC相关性和预后的研究 [4]。本文基于数据库研究阐明HNSCC中TBX2基因表达与临床病理参数和预后价值的关联，进一步探索TBX2的甲基化cg位点与HNSCC预后的关系。

1 资料与方法

1.1 数据预处理和差异表达分析

从UCSC Xena数据库（http://xena.ucsc.edu/）[5]下载HNSCC癌症样本和正常样本的mRNA表达谱、相关临床数据和甲基化文件（TCGA-HNSC.methylation450.tsv）；采用Perl软件从HNSCC的HTSeq中提取TBX2的mRNA表达；从基因表达综合（Gene Expression Omnibus, GEO）数据库（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/）[6]下载GSE 6631、GSE 2379、GSE 83519相关数据集，与健康对照相比；使用R软件ggpubr包计算HNSCC癌症样本和对照样本的TBX2 mRNA的差异表达。

1.2 TBX2在HNSCC中的蛋白表达

人类蛋白质图谱（Human Protein Atlas, HPA）数据库（https://www.Proteinatlas.org/）[7]包含有关人体组织和细胞的蛋白质分布信息，在该数据库输入目的基因TBX2，选择HNSCC下的“单细胞”和“免疫组织化学”板块。分析TBX2在HNSCC组织和细胞水平上的蛋白差异表达。

1.3 TBX2在HNSCC中的临床预后

UALCAN（http://ualcan.path.uab.edu/）[8]是一个交互式门户网站，用于绘制生存曲线和进行临床病理差异分析。在网站输入目的基因TBX2，链接窗口下选择“生存”和“甲基化”板块，分析HNSCC患者不同临床病理因素中TBX2 mRNA表达与其预后的相关性。

1.4 TBX2 mRNA的表达和甲基化水平

UALCAN用于研究HNSCC中TBX2的启动子甲基化水平。采用Perl软件分析“TCGA-HNSC.methylation450.tsv”文件中TBX2的甲基化水平。采用R语言plyr和ggpubr包绘制甲基化箱线图；采用R软件包dplyr和ggpubr分析TBX2 DNA启动子区域cg位点的甲基化水平。

1.5 cg位点甲基化水平和TBX2 mRNA表达的存活分析

基于TBX2 mRNA表达和甲基化水平将HNSCC患者分为高表达组和低表达组。采用R软件包survminer和survival对高表达组和低表达组进行生存分析。

1.6 TBX2单基因富集分析

以MSigDB数据库（https://www.gsea-msigdb.org/gsea/msigdb/）[9]中的c2.cp.kegg.v7.5.1.symbols.gmt和c5.go.v7.5.1.symbols.gmt数据集作为功能基因集，对TBX2进行单基因功能和通路富集（错误发现率＜0.05）。

1.7 统计分析

采用R软件（v4.1.3）对数据进行分析，采用Kaplan-Meier分析计算HNSCC高表达组和低表达组之间的生存差异，Spearman相关性分析法计算TBX2基因甲基化水平和基因表达之间的关系。基于组间差异的卡方检验估计分类变量，采用Kruskal-Wallis检验分析连续变量。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 TBX2在HNSCC和正常组织中的表达

TBX2在HNSCC肿瘤组中mRNA表达高于对照组（P＜0.001），见图1-A；通过GEO数据库的RNA-seq数据进一步分析发现，TBX2在肿瘤组中的表达明显升高（P＜0.05），见图1-B；通过HPA数据库分析发现，TBX2的蛋白表达在肿瘤组中升高，多集中于细胞核（图1-C），在HNSCC细胞系中其多表达于RPMI-2650细胞系（图1-D）。

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  图1 TBX2在HNSCC和正常组织中的表达

  Figure 1.Expression of TBX2 in HNSCC and normal tissues

  注：A. TBX2在人类正常组别和HNSCC肿瘤组中的mRNA表达；B. GSE6631数据集中TBX2的表达水平；C. HPA数据库中人类正常组织和HNSCC组织表达；D. TBX2在HNSCC细胞系中表达。*P<0.05，**P<0.01。

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2.2 TBX2表达与临床病理特征的关系

通过Kaplan-Meier分析评估TBX2表达与患者生存期之间的关系，未发现显著差异（P=0.53），见图2-A；在TBX2 mRNA表达水平与HNSCC患者临床病理特征进展关系方面，随着年龄增长，其表达随之上升（图2-B）；在临床分级中，肿瘤组中的1、2、3、4级TBX2表达均高于对照组（P＜0.001），在临床分期中，肿瘤组中的1、2、3、4级TBX2表达均高于对照组（P＜0.05），见图2-C、图2-D。

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  图2 TBX2的预后和临床病理特征

  Figure 2.Prognostic and clinicopathologic characteristics of TBX2

  注：A. TBX2在人类正常组别和HNSCC肿瘤组中的mRNA表达；B. GSE6631数据集中TBX2的表达水平；C. HPA数据库中人类正常组织和HNSCC组织表达；D. TBX2在HNSCC细胞系中表达。*P＜0.05，**P＜0.01。

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2.3 TBX2在HNSCC中甲基化水平与mRNA表达的相关性

在UALCAN数据库中，甲基化分析板块包含528份HNSCC样品和50份正常样品。结果显示，与正常样本相比，HNSCC组织中TBX2基因的甲基化程度较高（P＜0.01），见图3-A。“TCGA-HNSC.methylation450.tsv”文件共包含580份样品，TBX2基因中有22个甲基化CG位点（图3-B）。TBX2甲基化水平与mRNA呈负相关（r=-0.19，P＜0.001），见图3-C。TBX2六个不同位点（cg11031701、cg19021197、cg27027242、cg12163132、cg10930156、cg02577108）甲基化水平与mRNA呈显著负相关（P＜0.05），见图3-D，与其他位点相关性差异不显著（P＞0.05）。

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  图3 TBX2基因甲基化水平与mRNA表达的相关性

  Figure 3.Correlation between methylation level of TBX2 gene and mRNA expression

  注：A. TBX2基因甲基化在HNSCC组织中的表达水平；B. TBX2 DNA启动子CpG位点的分布；C. TBX2甲基化水平与mRNA相关性比较；D. TBX2不同位点甲基化水平与mRNA相关性比较。**P＜0.01。

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2.4 TBX2在HNSCC中各甲基化cg位点的预后

TBX2甲基化水平低的cg位点（cg13274713、cg02577108、cg10492801、cg04304770、cg05162750、cg10930156）与不良OS相关（图4-A），TBX2的cg位点（cg13274713、cg04304770、cg02577108、cg21977256、cg26932779、cg27027242、cg10492801、cg22449107）的低甲基化水平与不良PFS相关（图4-B），而其他甲基化cg位点与HNSCC患者的预后无关。

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  图4 TBX2基因甲基化与临床病理参数的关联

  Figure 4.Association of TBX2 gene methylation with clinicopathological parameters

  注：A. TBX2的cg位点甲基化水平与OS生存曲线；B. TBX2的cg位点甲基化水平与PFS生存曲线。

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2.5 TBX2通过基因集富集分析进行通路富集

采用基因富集分析（gene set enrichment analysis, GSEA）探究TBX2对HNSCC主要生物学过程的影响。基因本体（gene ontology, GO）功能富集分析结果显示，TBX2主要富集于生物过程（biological process, BP）中非编码RNA3'端加工、小核RNA代谢过程、翻译起始等；细胞组成（cellular component, CC）有免疫球蛋白复合物；分子功能（molecular function, MF）有翻译调节剂活性核酸结合等（图5-A）。从京都基因和基因组数据库（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes, KEGG）基因集中富集到通路包括钙信号通路、黏着斑、黑色素瘤、神经活性配体与受体相互作用、蛋白酶体等（图5-B）。

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  图5 GSEA通路富集

  Figure 5.Enrichment of GSEA pathways

  注：A. GO富集；B. KEGG富集。

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3 讨论

TBX2编码参与发育过程调控的转录因子可作为诊断和预后生物标志物，甚至是新的治疗靶点。目前仅有少量研究探索HNSCC中TBX2表达与临床病理参数和预后的关系。在喉癌、甲状腺乳头状癌和鼻咽癌中，TBX2的mRNA表达水平上调，且与淋巴结转移、分化程度相关，但在HNSCC中鲜有报道[10]。本研究探讨了TBX2在HNSCC中的表达和甲基化及其临床病理参数和预后的关系，发现TBX2 mRNA和蛋白表达显著高于邻近正常组织，不同TBX2表达水平HNSCC患者的OS无明显差异，TBX2基因部分cg位点甲基化水平与OS和PFS显著相关，TBX2是HNSCC中重要的诊断和预后生物标志物。

异常的DNA甲基化已被证实会改变肿瘤微环境，可用于疾病诊断和预后预测。甲基化谱对于鉴定基因的功能状态至关重要，因其表达依赖于DNA CpG岛的甲基化状态。根据文献，某些基因的异常DNA甲基化可能在HNSCC病理生理和发展中起着关键作用[11]。DNA甲基化异常可使与细胞增殖相关的基因表达异常，从而导致细胞增殖异常。早期研究表明，同源重组DNA修复途径中XRCC3 c.722、Lig4 c.26和Rad51 c.3429单核苷酸多态性与HNSCC风险之间显著相关，而单核苷酸多态性在CG序列上出现最为频繁[12]。本研究探讨了cg位点的甲基化水平与预后之间的关联，结果显示，与健康对照组相比，HNSCC中的TBX2表达较高，但甲基化同样较高。此外，TBX2甲基化水平低的cg位点（cg13274713、cg02577108、cg10492801、cg04304770、cg05162750、cg10930156）与不良OS相关，TBX2 cg位点（cg13274713、cg04304770、cg02577108、cg21977256、cg26932779、cg27027242、cg10492801、cg22449107）的低甲基化水平与不良PFS有关，提示cg13274713、cg02577108、cg10492801、cg04304770这4个位点是未来研究的重点，可能被用作HNSCC的预后和治疗靶点。由于有关TBX2基因的cg位点研究有限，现仅发现其在高血压中具有易感性[13]。

为进一步探讨TBX2导致肿瘤发生的具体机制，本研究采用GSEA探究了TBX2对HNSCC主要生物学过程的影响。GO富集分析到分子功能翻译调节剂活性核酸结合。不论是非编码RNA相关n6-甲基腺苷对免疫球蛋白的识别和3'端加工，还是小核仁RNA都已被证明通过28'-O-甲基化修饰在癌症发展中起着关键的调节作用，证实基因甲基化及其潜在的cg位点在肿瘤预后中发挥着潜在作用[14-15]。从KEGG基因集分析中富集到通路包括钙信号通路、神经活性配体与受体相互作用、蛋白酶体和细胞外基质。有研究指出蛋白酶体抑制剂硼替佐米治疗头颈癌，TBX2可诱导HAS2基因表达并增加透明质酸沉积，从而重塑肿瘤微环境[16]。早期有研究显示，原发癌细胞向远处器官的转移被认为是由上皮-间充质转化（epithelial-mesenchymal transition, EMT）诱导控制的，TBX2可能通过调节EMT和转移前生态位的建立，在许多恶性肿瘤的转移中起着至关重要的作用，TBX2过表达通过EMT和ERK信号通路促进胃癌增殖和侵袭，E-钙黏蛋白增加可抑制细胞入侵[17]。研究表明TBX2抑制明显增加了E-钙黏蛋白的表达，并且抑制了体外鼻咽癌细胞的侵入与迁移[10]。生信结果与已有基础研究结果相互验证，但TBX2对HNSCC的生物学过程还需要基础实验进一步验证。

本研究存在一定的局限性，尽管采用了生物信息分析，但缺乏了实际临床研究，降低了研究的可行性。综上所述，TBX2表达与HNSCC患者的肿瘤分级分期有关，但与OS无关。此外，与正常样本相比，HNSCC组织中TBX2基因的甲基化程度较高，TBX2基因中某些cg位点的低甲基化水平与不良的OS和PFS密切相关。整合甲基化和基因表达分析支持TBX2作为HNSCC中的特异性诊断和预后生物标志物。

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