目的  探讨铜死亡相关的长链非编码RNA（long non-coding RNA，lncRNA）在喉癌临床预后预测和免疫治疗中的作用。

方法  使用癌症基因组图谱（The Cancer Genome Atlas，TCGA）数据库中的基因组和临床数据，通过LASSO分析和Cox回归分析构建预后模型，使用主成分分析、时间依赖性受试者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲线和一致性指数评估其临床效能；从肿瘤突变负荷、肿瘤免疫功能障碍和排除、肿瘤干性指数等多个维度分析风险模型的预后价值；最后通过基因集富集分析（gene set enrichment analysis，GESA）探索模型高风险组的细胞功能和通路富集。

结果  共得到5个与铜死亡相关的lncRNA预后模型。主成分分析、ROC曲线下面积（area under the curve，AUC）超过0.8、一致性指数表明所建立的风险模型具备出色的预测能力；在高低风险患者中，风险曲线与免疫相关功能无显著相关性，与RNA干性评分呈负相关（r=-0.21，P=0.025）；富集分析表明，lncRNA的生物学功能与WNT信号通路有关。

结论  铜死亡相关的lncRNA可能是一种新的预测喉癌预后的生物标志物，并可能为喉癌的治疗提供新途径。

喉癌属于头颈鳞癌的一种，多表现为进食呛咳和呼吸窘迫，对人类健康构成严重威胁[1]。喉癌的治疗手段包括手术、放疗和化疗[2]。晚期喉癌生存率下降，癌细胞转移会导致严重的健康损害。近年来，肿瘤风险预测评分模型作为一种非侵入性方法，已被证实能够有效预测患者的存活率，并在临床实践中得到逐步推广[3-4]。因此，创建喉癌预测模型有助于在临床治疗前评估患者的生存率，从而进行精准治疗。

当机体受到刺激后，细胞内铜的积累会导致Fe-S簇蛋白的不稳定，这是一种独特细胞死亡类型[5]。既往临床试验表明，与正常组织相比，各种恶性肿瘤中的铜含量更高，且铜积累与肿瘤的增殖和生长有关[6]。因此，研究铜死亡在癌症中的作用具有较大的临床应用潜力。长链非编码RNA（long non-coding RNA，lncRNA）在多种肿瘤的发生与进展中扮演着重要角色，并在调控肿瘤细胞的增殖、迁移和侵袭等方面发挥作用[7]。有研究显示，外泌体lncRNA LINC02191通过靶向miR-204-5p/RAB22A轴及调节磷脂酰肌醇3-激酶 /蛋白激酶B/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白信号通路（PAM信号通路）促进喉鳞癌进展[8]。本研究应用生物信息学分析喉癌患者的铜死亡相关lncRNA及其生物学和预后，探讨其在预测喉癌患者预后中的生物学功能及作用。

1 资料与方法

1.1 铜死亡相关lncRNA的数据处理与鉴定

从癌症基因组图谱（The Cancer Genome Atlas，TCGA）数据库（https://portal.gdc.cancer.gov/）下载基因表达的RNA-Seq数据和喉癌的相应临床和突变数据，其中包含12例正常个体和111例喉癌患者。根据TCGA的基因注释获得RNA-Seq数据，以区分lncRNA。为了鉴定与铜死亡相关的lncRNA，使用limma、dplyr、ggalluvial和ggplot2软件包进行Pearson相关性分析，确定铜死亡相关基因表达水平与lncRNA表达之间的关系。使用的阈值为|r|＞0.4和P＜0.001。

1.2 预后铜死亡相关lncRNA模型构建

铜死亡相关基因列表来自铜死亡相关研究[9-11]。基于1 000倍交叉验证对显著表达的lncRNA进行Lasso Cox回归，以识别铜死亡相关的lncRNA。基于多变量Cox回归分析确定最佳预后lncRNA，然后计算风险评分[12]。将每个lncRNA的表达水平（Exp值）及其对应的回归系数（β）相乘，然后将所有乘积项相加，得到综合风险评分，即风险评分=Exp lncRNA1×β lncRNA1+Exp lncRNA2×β lncRNA2+Exp lncRNA3×β lncRNA3 +…+ Exp lncRNAn×β lncRNAn（n为样本数）。

1.3 风险评分分组能力评估

根据风险评分的中值将患者分为高、低风险组，使用pheatmap包绘制基于风险评分的基因表达热图；采用Kaplan-Meier生存分析，使用Survival包绘制各组喉癌患者的总生存期（overall survival，OS）、无进展生存期（progression-free survival，PFS）和患者肿瘤分级下生存曲线；使用Survival和ROC包计算风险曲线的时间依赖性受试者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲线下的1年、3年和5年面积（area under the curve，AUC）；使用R的rms和pec包生成一致性指数（concordance index，C-index）曲线。

1.4 主成分分析

使用R语言中limma和scatterplot3d软件包进行主成分分析（principal component analysis，PCA），由此产生的输出以矩阵形式展示了高风险和低风险群体的空间分布，用于评估模型的准确性。

1.5 肿瘤突变负荷分析

利用maftools软件包，通过读取高风险和低风险样本的基因突变文件，对突变频率前15个基因可视化，检测两组间的遗传变异。此外，使用ggpubr、survival和survminer包比较高风险组和低风险组样本之间的肿瘤突变负荷（tumor mutational burden，TMB）和存活率。

1.6 免疫相关功能分析

采用R语言中limma、GSVA包分析喉癌患者免疫相关功能的差异，pheatmap包用于可视化结果。从肿瘤免疫功能障碍和排除（tumor immune dysfunction and exclusion，TIDE）分析网站（http://tide.dfci.harvard.edu/）探索风险曲线和免疫功能障碍和排斥的关系[13]。

1.7 喉癌干性指数

通过UCSC Xena数据库（https://xenabrowser.net/）下载TCGA泛癌两类干性评分数据（StemnessScores_DNAmeth_20170210.ts和StemnessScores_RNAexp_20170127.2.tsv），使用limma、ggExtra、ggplot2软件包进行可视化分析。

1.8 功能富集

下载MSigDB数据库中c2.cp.kegg.v7.5.1. symbols.gmt和c5.go.v7.5.1.symbols.gmt文件作为功能基因集，进行基因本体论（gene ontology，GO）和京都基因与基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）富集，随机组合次数设为1 000次、错误发现率＜0.05、标准化富集得分＞1、P＜0.05。

1.9 统计分析

采用R 4.0.3软件对数据进行分析。通过ROC曲线、C指数和PCA曲线评估模型的预测性能，Spearman相关检验分析基因表达间的相关性，生存曲线比较采用Kaplan-Meier法和Log rank检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 铜死亡相关lncRNA的鉴定与预后模型构建

以|r|＞0.4和P＜0.001为标准，从16 773个lncRNA和19个铜死亡相关基因中鉴定出570个铜死亡相关lncRNA，两者之间的共表达关系见图1。单变量Cox回归分析筛选出17个lncRNA（图2-A），Lasso Cox回归分析确定与铜死亡相关的lncRNA（图2-B）。多变量Cox分析确定5个lncRNA作为独立预后因素，并建立风险评估模型，其风险评分=（AL158166.2×4.594 224 454 551 14）+（HOXB-AS3×2.83871554342233）-（AC091729.2×

5.560 000 728 450 9）+（AC121764.1× 4.888 326 291 011 31）+（MAP3K2-DT× 2.092 706 823 954 72）。热图显示了5个lncRNA在不同风险亚组中的相对表达情况：AL158166.2、HOXB-AS3、AC121764.1、MAP3K2-DT为高风险lncRNA，而AC091729.2为低风险lncRNA（图2-C）。同时相关热图还显示了铜死亡相关基因PDHB、LIPT2、GCSH与5个lncRNA较为密切（图2-D）。

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  图1 铜死亡相关基因和喉癌相关lncRNA桑基图

  Figure 1.Sankey map of genes associated with cuproptosis and lncRNAs associated with laryngeal cancer

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  图2 铜死亡相关lncRNA预后模型

  Figure 2.Prognosis model of lncRNA associated with cuproptosis

  注：A. 单因素Cox森林图；B. LASSO回归筛选lncRNA；C. 风险模型基因高低表达热图；D. 相关性热图。

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2.2 不同风险组的临床病理特征分层预后

风险曲线反映了喉癌患者的风险评分与生存状态之间的关系，生存分析结果表明，低风险组患者中位OS和PFS约为6个月，而高风险组患者中位OS和PFS约为3个月（P＜0.05），高风险组患者的OS和PFS明显短于低风险组患者（图3-A、图3-B）。进一步分析两组在临床分期方面的差异，结果显示，低风险组患者在不同临床分期下的中位生存期约为6个月，高风险组患者的生存可能性仅2~3个月（P＜0.05），不同分级（1~2和3~4期）高风险组患者生存期均低于低风险组（图3-C、图3-D），表明风险评分较高的患者预后较差。

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  图3 喉癌患者的Kaplan-Meier生存分析

  Figure 3.Kaplan-Meier survival analysis of patients with laryngeal cancer

  注：A. 高低风险组喉癌患者的OS；B. 高低风险组喉癌患者的PFS；C. 1～2级喉癌患者生存曲线；D. 3～4级喉癌患者生存曲线。

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2.3 风险模型的预后能力验证

采用单因素和多因素生存回归分析，探讨喉癌风险模型的独立预后模型。单变量Cox回归结果

显示，患者性别风险比（hazard ratio，HR）为0.292，与OS独立相关（P＜0.05）。多变量Cox回归结果显示，性别[HR=0.236（0.097，0.572），P＜0.05]与OS独立相关，表明风险模型是喉癌患者的独立预后因素（图4-A、图4-B）。采用ROC曲线评估风险评分的预测准确性，在风险模型中，1年、3年和5年OS分别为0.809、0.699和0.745（图 4-C），风险评分的AUC为0.809，优于年龄（0.516）、性别（0.377）、分级（0.498）和分期（0.484）（图 4-D）。该风险模型的C指数值高于其他临床特征（图4-E），表明该模型具有良好的预测能力。

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  图4 风险模型的预后能力验证

  Figure 4.Validation of prognostic proficiency of risk models

  注：A. 单变量Cox回归；B. 多变量Cox回归；C. 生存时长ROC曲线；D. 临床特征ROC曲线；E. C指数曲线。

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2.4 主成分分析

PCA分析结果表明，在喉癌患者中，无论是所有基因（图5-A）、铜死亡相关基因（图 5-B），还是铜死亡相关lncRNA（图5-C），均未能显著区分不同高低风险患者。相对而言，基于风险模型的分析揭示了两种风险聚类间重叠较小，表明模型能够有效区分低风险和高风险患者群体（图 5-D），从而验证了该风险模型在构建过程中的可靠性。

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  图5 主成分分析结果

  Figure 5.Results of PCA

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2.5 高低风险人群的肿瘤突变负荷及相关预后

使用maftools算法观察高风险组和低风险组的突变，发现对于大多数基因，高风险组的突变频率高于低风险组（TP53：低风险，75%；高风险：84%；TTN：低风险，52%；高风险，54%；CSMD3：低风险，33%；高风险，37%），见图 6-A、图6-B。此外，高低风险组之间的TMB差异并不显著（P=0.93），见图6-C。高突变负荷组和低突变负荷组的存活率无显著差异（P=0.21），见图6-D。综合生存分析结合风险评分显示，四组患者的生存时间差异有统计学意义（P＜0.05），高突变和低风险患者的生存时间最长，低突变和高风险患者的生存时间较短（图6-E）。

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  图6 高低风险人群的肿瘤突变负荷及相关预后

  Figure 6.TMB and associated outcomes in high - and low-risk populations

  注：A、B. 高低风险组突变基因的瀑布图；C. 喉癌中高低风险组的TMB差异；D. 高低TMB生存曲线；E. 高低TMB结合高低风险组生存曲线。

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2.6 肿瘤干细胞和免疫分析

风险模型仅对基质细胞评分具有正相关作用（r=0.24，P=0.013）（图7-B），对免疫细胞评分基因则无（r=0.05，P=0.6）（图7-A、图7-C）。TIDE算法是近年开发的用于确定肿瘤免疫检查点治疗效果的工具[13]。使用TIDE算法进一步研究高风险组和低风险组患者对免疫治疗敏感性的差异，发现除了MSI Expr Sig低风险组的TIDE评分与高风险组相比有差异外，其他免疫指标均无统计学意义（图7-D）。干性指数是评估肿瘤细胞与干细胞相似性的指标，反映了肿瘤细胞中的干细胞特征，如自我更新能力和多向分化潜能。通过UCSC Xena数据库探索高低风险组的与干细胞相关性，结果显示，风险曲线与RNAss呈负相关（r=-0.21，P=0.025）（图7-E），与DNAss无明显相关性（P=0.069）（图7-F）。

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  图7 免疫相关功能分析

  Figure 7.Analysis of immune-related functions

  注：A. 免疫细胞评分；B. 基质细胞评分；C. ssGSEA免疫细胞和功能分析；D. TIDE和MSI Expr Sig算法；E. RNAss；F. DNAss评分。

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2.7 功能富集分析

基因集富集分析（gene set enrichment analysis，GESA）结果显示，在高风险组中，GO富集分析的前五位显著富集项包括适应性免疫应答、骨骼系统发育、外部包膜结构、高尔基体内腔及免疫球蛋白复合体（图8-A）。同时，KEGG通路富集分析指出，前五位显著富集的途径包括细胞外基质（extracellular matrix，ECM）受体相互作用、刺猬（Hedgehog）信号通路、WNT信号通路、基底细胞瘤、黑素瘤（图8-B）。

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  图8 风险曲线在喉癌中功能富集分析

  Figure 8.Functional enrichment analysis of risk curves in laryngeal carcinoma

  注：A. GO富集；B. KEGG富集。

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3 讨论

喉癌作为呼吸道常见恶性肿瘤，过去几年在治疗策略上虽有所进步，但由人类乳头瘤病毒感染率检测方法差异引起的研究间结果不一致性，仍对临床治疗构成挑战[14]。鉴于此，开发一个精确的喉癌风险评估模型对于患者的预后判断和生存期预测具有重要的临床价值。lncRNA是一类非蛋白质编码RNA，通过转录调控等影响肿瘤发生发展[15]。研究发现，RASSF8-AS1通过靶向miR-664b-3p/TLE1轴在喉鳞状细胞癌中显示出抑制作用[16]。lncRNA-NEAT1通过海绵状miR- 577/miR-1224-5p阻断细胞凋亡途径[17]。这些发现表明lncRNA有潜力成为新的喉癌生物标志物和治疗靶点。铜死亡是与线粒体三羧酸循环密切相关的一种新型细胞死亡方式，尽管已有针对铜离子的小分子抗癌药物依来昔洛尔的临床试验，但其治疗效果并不理想[10, 18]。因此，铜死亡与lncRNA在喉癌中的相互作用及其调节机制亟待进一步研究。

本研究初筛17个预后铜死亡相关lncRNA。通过多变量Cox回归分析，进一步确认了AL158166.2、HOXB-AS3、AC121764.1、MAP3K2-DT和AC091729.2作为构建预后模型的关键lncRNA。ROC、生存曲线、C-index分析结果表明，5种铜死亡相关lncRNA的预后模型可准确区分高风险和低风险人群，能可靠地预测喉癌患者的预后。有研究表明，MAP3K2-DT表达与乳腺癌患者中的TGFβ1表达呈正相关[19]。而HOXB-AS3在多种癌症中发挥重要作用，包括缩短头颈鳞癌患者的生存期，并通过miR-378a-3p在卵巢癌中上调细胞外酸化率，促进肿瘤细胞的增殖、侵袭和迁移，以及通过与DNMT1的结合影响肝癌细胞的增殖和凋亡[20-22]。

肿瘤干细胞被广泛认为是导致肿瘤复发的关键因素，而肿瘤干性指数的开发旨在精确识别并量化肿瘤中具有此类干细胞特性的细胞群，为癌症干细胞的检测与监控提供了一种有效的量化工具。Zhang等研究发现，与亲本细胞相比，喉癌干细胞样细胞在小鼠体内具有更强的肿瘤形成能力和化疗抵抗性[23]。GSEA通路分析表明，铜死亡相关的lncRNA可能与WNT信号传导途径的发展有关。Tang等报道了DGCR5通过激活人喉癌细胞中的WNT信号通路，促使miR-506形成海绵状结构，诱导肿瘤干细胞样特性[24]，与本研究所得干性指数相符。但目前仍缺乏铜死亡与喉癌干细胞相关的基础研究，未来或可以此为研究方向。

有研究表明，喉癌中肿瘤-宿主边界处的基质肿瘤浸润淋巴细胞与免疫系统激活相关基因的表达和预后显著相关[25]。然而，在本研究风险模型中，高低风险曲线与免疫细胞及其功能之间未发现显著关联。TMB作为免疫检查点阻断治疗的预测生物标志物，在临床上已被证实在耐辐射头颈鳞癌组中较对照组更高，提示免疫治疗可能是更合适的治疗选择[26-27]。在高风险患者中，TP53和TTN的表达水平上升，其中TP53是多种癌症中常见的突变基因，影响多种癌症的发展及患者生存率，而TTN的参与则与多种癌症的发展相关，TTN-AS1的过表达与多种癌症的不良预后相关[28-29]。这表明TP53和TTN可能成为喉癌免疫治疗的新靶点。lncRNA与免疫相关功能之间的确切关系尚未完全阐明，未来应评估喉癌患者中免疫细胞浸润的预后价值，并进一步探讨免疫细胞在铜死亡介导的喉癌患者靶向治疗中的作用。本研究存在一些局限性：首先，研究结果基于公共生物数据库，缺乏临床样本的直接验证；其次，对于预后模型中的免疫作用及其机制仍需深入研究，这将是未来研究的重点。

综上，本研究中为喉癌构建了铜死亡相关的lncRNA模型，并分析了风险评分与TMB、免疫治疗和肿瘤干性指数之间的关联，从而为喉癌患者的预后预测和临床治疗提供参考。

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