目的  在大肠杆菌中重组表达并纯化得到高产量、高纯度的鸢尾素（Irisin）重组蛋白，为后续Irisin的功能研究奠定基础。

方法  对Irisin基因CDS序列密码子优化后进行基因合成，通过一步克隆连接法构建重组质粒pET-30a-Irisin，将其转化到大肠杆菌表达感受态细胞Rosetta（DE3）中。以终浓度为0.5 mM的IPTG在15 ℃、100  rpm诱导表达30 h。诱导表达结束后收集菌体，超声波破碎细菌细胞，离心取上清，用Ni-IDA琼脂糖纯化树脂进行纯化。

结果  成功构建得到重组质粒pET- 30a-Irisin，重组表达菌株经低温、低浓度IPTG诱导，经Ni-IDA琼脂糖纯化树脂纯化得到产量为105  mg·L^-1的高纯度Irisin重组表达产物。

结论  密码子和诱导条件优化可促进Irisin重组蛋白在大肠杆菌中的可溶性表达，为研究其对不同肿瘤细胞的影响及机制奠定坚实基础。

鸢尾素（Irisin）是Boström等于2012年发现的一种新型肌肉因子，由含Ⅲ型纤连蛋白结构域蛋白5（fibronectin type Ⅲ domain-containing protein 5，FNDC5）水解产生[1]。Irisin广泛分布于人体内，主要参与白色脂肪组织的褐变、改善胰岛素抵抗、改善认知功能、调节骨代谢等[2]。Irisin与多种肿瘤的发生发展密切相关，能够通过多种信号通路促进或抑制肿瘤细胞增殖和迁移。朱英雪的研究发现，Irisin可促进卵巢癌细胞增殖 [3]，也有研究证明其在胆管癌、胰腺癌中发挥抑制作用[4-5]，因此可以作为一种有效的生物标志物来诊断多种类型的肿瘤[6-7]。然而，Irisin在肿瘤发展过程中的分子机制尚未明确。何赛等在大肠杆菌表达系统中进行了Irisin的重组表达，重组蛋白产量约为2 mg·L^-1,并通过Ni-IDA琼脂糖纯化树脂得到了纯度较高的重组蛋白[8]，但产量过低不利于研究其在肿瘤发展过程中的分子机制。本研究通过对Irisin基因进行密码子优化，采用同源重组的方法在大肠杆菌表达感受态细胞Rosetta（DE3）中重组表达并纯化得到高产量、高纯度的Irisin，以期为后续研究Irisin对不同肿瘤细胞的影响及作用机制奠定基础。

1 资料与方法

1.1 实验菌株、质粒及主要试剂药品

大肠杆菌化学感受态细胞DH5α、核酸染料GelRed、蛋白质Marker、DNA聚合酶均购自南京诺唯赞生物科技股份有限公司，DNA胶回收试剂盒、质粒提取试剂盒购自天根生化科技（北京）有限公司，限制性内切酶、DNA marker购自赛默飞世尔科技公司，一抗、二抗均购自爱博泰克生物科技有限公司，Ni-IDA琼脂糖纯化树脂及实验中使用的其他生化试剂均购自生工生物（上海）股份有限公司，大肠杆菌表达感受态细胞Rosetta （DE3）、表达质粒pET-30a均为本实验室保藏。

1.2 重组表达载体的构建

根据GenBank中Irisin基因CDS序列（NM_001171940.2），依照大肠杆菌密码子的偏好性，在不改变氨基酸序列的前提下，利用密码子优化软件GeneOptimizer对Irisin基因进行密码子优化后发送至北京擎科生物科技有限公司进行基因合成。用两侧带有pET-30a质粒EcoRV位点重组linker的引物Irisin F ACGACAAGGCCATGGCTGATGACTCTCCTTCCGCTCCTGTT和Irisin R AGCTCGAATTCGGATCCGATTTCCTTCATAGTAACTTCATCCTT进行聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）扩增，得到Irisin基因片段。通过同源重组连接法将胶回收的Irisin基因片段连接到pET-30a质粒的EcoRV酶切位点，将连接产物通过化学转化法转化到大肠杆菌的DH5α菌株中，菌液复苏后涂布于含有50 μg·mL^-1卡那霉素的LA平板进行筛选，挑取单菌落进行菌落PCR验证，获得DH5α-pET30a-Irisin重组菌株。以S.TAG引物CGAACGCCAGCACATGGACA和T7 TER引物TGCTAGTTATTGCTCAGCGG作为引物对进行PCR验证，pET-30a空载做阴性对照模板，按照DNA聚合酶2×Taq Master Mix（Dye  Plus）的使用说明书配置PCR反应体系，前后引物各1 μL，2×Tag Master Mix 10 μL，ddH₂O 7 μL，体系中不加入模板，在EP管中均匀混合，以每管19  μL分装到PCR管中。在细菌超净台中用无菌牙签挑取LA转化平板上的单菌落，在新的LA平板上点种并做好标记，然后将带菌的牙签在PCR管反应液中涮动混合，阴性对照以pET-30a空载质粒作为模板，将PCR管放入设定好程序的PCR仪中进行扩增，点种的LA平板放入37 ℃的细菌培养箱过夜培养。待PCR反应结束，取出样品，以1 kb DNA Ladder Marker作为标准进行琼脂糖凝胶电泳，根据Marker初步判断重组转化子验证条带大小是否正确。挑取菌落PCR验证正确的转化子接种到含5 mL LB培养基的指形瓶中，37 ℃，200 rpm摇床培养12 h，提取质粒，送至北京擎科生物科技有限公司进行测序分析，测序正确的重组质粒命名pET-30a-Irisin。

1.3 重组蛋白的诱导表达

将测序正确的重组质粒pET-30a-Irisin通过CaCl₂化学转化法转化到Rosetta（DE3）大肠杆菌表达感受态中，在含有25 μg·mL^-1卡那霉素和34  μg·mL^-1氯霉素的LA平板上，37 ℃培养箱过夜。挑取大肠杆菌重组转化子接种到装5 mL LB培养基的指形瓶中，37 ℃，200 rpm摇床培养12 h后获得种子液，将其以1%的接种量接入含有200 mL  LB培养基的锥形瓶中，200 rpm、37 ℃摇床培养2~3 h，待OD₆₀₀值达到0.4~0.6，在冰水混合物中预冷30 min，加入终浓度为0.5 mM的IPTG，15 ℃、100 rpm，摇床培养30 h。

1.4 重组蛋白的纯化

诱导结束后，4 ℃，4 000 rpm，离心10 min，收集菌体，加入25 mL细胞裂解液，涡旋使菌体重悬，在冰水浴中超声30 min破碎细胞。4 ℃，12 000 rpm，离心10 min，收集上清液。将上清液与平衡后的Ni-IDA琼脂糖纯化树脂填料充分混合，依次向吸附柱中加入浓度为80、100、250 mM的咪唑缓冲液，每次加入2 mL，让液体自然流下，分别收集洗脱液。使用BCA蛋白质浓度测定试剂盒测定浓度，加入终浓度2 mM的PMSF混匀后4 ℃保存。

1.5 重组蛋白的分析

通过SDS-PAGE凝胶电泳和Western-Blot对重组蛋白进行分析。制备SDS-PAGE凝胶，分离胶浓度为12%，浓缩胶浓度为5%。取20 μg蛋白样品与5×Loading buffer混合均匀，100 ℃金属浴煮10 min，12 000 rpm离心1 min后，取上清液进行电泳，分析重组蛋白的表达和纯化情况。通过Western-Blot进一步验证重组蛋白，取蛋白样品进行SDS-PAGE凝胶电泳，随后转膜以及封闭。一抗4 ℃冰箱摇床过夜，次日加入二抗在室温摇床孵育1 h，最后显影分析Irisin在大肠杆菌中的表达情况。

2 结果

2.1 Irisin基因CDS序列密码子优化及大肠杆菌重组表达载体的构建

Irisin基因CDS序列密码子优化前后对比见图1，密码子中标注红色的碱基为优化后的碱基。经EcoRV单酶切后的pET-30a质粒和胶回收的Irisin目的基因进行琼脂糖凝胶电泳，结果见图2，泳道1为EcoRV单酶切后的pET-30a质粒，大小介于5 000~6 000 bp，与pET-30a理论大小5 422 bp相符合；泳道2为胶回收后的Irisin目的基因，大小介于250~500 bp，与Irisin基因片段的理论大小376 bp相符合。

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  图1 Irisin基因CDS序列密码子优化前后对比

  Figure 1.Comparison of Irisin gene CDS sequence before and after codon optimization

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  图2 重组质粒构建

  Figure 2.Construction of recombinant plasmid

  注：M. 1 kb DNA marker；1. EcoRV单酶切后的pET-30a载体；2. Irisin基因片段。

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2.2 重组转化子菌落PCR验证和测序

在含有卡那霉素的LA平板上挑选重组转化子单菌落进行菌落PCR验证，见图3，泳道1为以pET-30a作为模板的阴性对照，条带大小略低于250 bp，与理论大小225 bp相符合；泳道2~4分别为不同重组转化子作为模板的PCR产物条带，条带大小约为500 bp，与理论大小624 bp相符。部分测序结果见图4，表明Irisin基因已连接到pET-30a质粒EcoRV酶切位点，且无碱基突变发生。

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  图3 重组转化子的菌落PCR验证

  Figure 3.Colony PCR validation of recombinant transformants

  注：M. 1 kb DNA marker；1. pET-30a空载为模板的阴性对照PCR产物；2～4. 不同重组转化子单菌落为模板的PCR产物。

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  图4 pET-30a-Irisin部分测序峰图

  Figure 4.Partial sequencing peaks of pET-30a-Irisin

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2.3 重组蛋白的表达和纯化分析

对大肠杆菌重组蛋白表达产物进行SDS-PAGE分析，如图5所示，泳道1为未加IPTG诱导的重组表达菌株裂解液上清，泳道2为经终浓度0.5 mM IPTG诱导的重组表达菌株裂解液上清，泳道3为250 mM咪唑缓冲液洗脱的Irisin重组蛋白。相较于泳道1，泳道2在10~15 kDa有明显增粗的蛋白条带，初步表明Irisin重组蛋白已表达。对纯化产物进行SDS-PAGE分析，250 mM咪唑缓冲液洗脱的Irisin重组蛋白呈现单一条带（如泳道3），且与理论大小（约为13 kDa）相符，表明经Ni-IDA琼脂糖纯化树脂纯化后可获得高纯度的Irisin重组蛋白，产量达105 mg/L。

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  图5 重组蛋白的SDS-PAGE分析

  Figure 5.SDS-PAGE analysis of recombinant proteins

  注：M. 蛋白相对分子质量标准；1. 未加IPTG诱导的重组表达菌株裂解液上清；2. 0.5 mM IPTG诱导的的重组表达菌株裂解液上清；3. 250 mM咪唑缓冲液洗脱的Irisin重组蛋白。

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2.4 重组蛋白的Western-Blot鉴定

为进一步对Irisin重组蛋白进行验证，取经IPTG诱导后的重组表达菌株裂解液上清进行Western-Blot鉴定（泳道1），显影后从图6中可见杂交条带与理论大小条带13 KDa相符，证明Irisin在大肠杆菌中表达成功。

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  图6 重组蛋白的Western-Blot分析

  Figure 6.Western-Blot analysis of recombinant proteins

  注：M. 蛋白相对分子质量标准；1. 经IPTG诱导后的重组表达菌株裂解液上清。

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3 讨论

全球每年新增癌症病例约1 300万，现阶段我国癌症新增病例和死亡病例均位于全球前列[9- 10]。研究发现，FNDC5/Irisin能够促进肝癌细胞的增殖、侵袭和迁移，并降低肝癌细胞对化疗药物的敏感性[11-13]。研究表明，Irisin可显著促进宫颈癌Hela细胞的增殖、迁移及侵袭，驱动细胞由G1期向S期转化，促进细胞增殖[14]。Alshanqiti等的研究发现，Irisin对前列腺癌细胞增殖具有显著的抑制作用[15]。相似的结果在肺癌中也有相关报道，FNDC5/Irisin能够抑制肺癌细胞的增殖和侵袭，并通过磷脂酰肌醇3激酶（phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K） /蛋白激酶B（protein kinase B，AKT）/Snail通路抑制上皮间质转化和减少肺癌细胞的侵袭[16]，也有研究证明其对乳腺癌具有抑制作用 [17]。上述研究表明Irisin与肿瘤的发生发展密切相关，有望成为诊断肿瘤的辅助生物标记物。然而，目前Irisin对不同肿瘤细胞的作用机制尚未明确。

何赛等首次实现了Irisin基因在大肠杆菌表达系统中的重组表达，但可溶性Irisin重组表达产物的产量仅有2 mg·L^-1，产量太低不利于进行后续机制研究[8]。本研究通过对Irisin基因进行密码子优化，将使用频率低的密码子优化为使用频率高的密码子，以提高蛋白质的翻译效率，进而提高重组蛋白的表达量。在较高的诱导温度下，大肠杆菌易形成包涵体，降低诱导温度可使热休克蛋白酶的表达下降，从而增加重组蛋白的稳定性和溶解度[18-19]。因此，本研究用冰水混合物将OD₆₀₀值达到0.4~0.6的培养物预冷30 min，再加0.5 mM IPTG，15 ℃进行诱导，以增加可溶性蛋白的产量。

本研究通过对Irisin基因进行密码子优化并采用一步克隆连接法，构建得到重组质粒pET-30a-Irisin，将其转入大肠杆菌表达感受态细胞Rosetta（DE3），经0.5 mM IPTG，15 ℃诱导后，获得产量为105 mg·L^-1的高纯度重组表达产物，为后续研究Irisin对不同肿瘤细胞的影响及作用机制奠定基础。

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