目的  运用整合药理学方法系统探究黄芪甲苷（astragaloside IV，AS-IV）治疗缺血性脑卒中（ischemic stroke，IS）的作用机制。

方法  通过多个数据库检索AS-IV的潜在作用靶点与IS的疾病靶点，并利用Venny网站筛选二者的共同靶点。借助STRING数据库构建蛋白质-蛋白质相互作用（protein-protein interaction，PPI）网络，利用Cytoscape 3.9.1 软件及CytoHubba插件筛选核心靶点。将AS-IV与IS的共同靶点输入DAVID数据库，并进行基因本体论（Gene Ontology，GO）和京都基因与基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）分析，以明确相关作用通路。使用AutoDock Vina 1.2.5软件对AS-IV与核心靶点进行分子对接验证，利用Pymol 2.5软件进行可视化对接。通过体外培养人神经母细胞瘤细胞株（SH-SY5Y细胞）建立氧糖剥夺/复糖复氧（OGD/R）模型，对AS-IV治疗IS的作用机制进行验证。

结果  共筛选出AS-IV潜在作用靶点371个、IS相关靶点121个、二者交集靶点41个。通过PPI分析确定了关键核心靶点，如BCL2、IL-6、TNF等。GO及KEGG分析结果表明，AS-IV治疗IS与NF-κB信号通路等相关。分子对接结果显示，AS-IV与10个核心靶点具有较强的结合能力。细胞实验结果表明，与空白组相比，模型组TNF、NF-κB、IL-6、Caspase-3、IL-1β水平均显著升高，BCL2水平显著降低（P＜0.05）；与模型组相比，AS-IV低、中、高剂量组及TNF抑制剂组TNF、NF-κB、IL-6、Caspase-3、IL-1β水平均显著降低，BCL2水平显著升高（P＜0.05）；与AS-IV中剂量组相比，AS-IV中剂量+TNF激动剂组TNF、NF-κB、IL-6、Caspase-3、IL-1β水平均显著升高，BCL2水平显著降低（P＜0.05）。

结论  AS-IV可以通过调控TNF/NF-κB信号通路抑制炎症反应，从而发挥治疗IS的作用。

缺血性脑卒中（ischemic stroke，IS）是全球范围内重要的致死和致残原因之一，给社会和家庭带来了巨大的经济和精神负担[1]。IS的病理生理过程是一个复杂的级联反应，涉及兴奋性毒性、氧化应激、血脑屏障破坏、炎症反应和细胞凋亡等多个环节，最终导致不可逆的神经元损伤和功能缺陷[2-4]。尽管IS急性期治疗（如静脉溶栓和机械取栓）已取得显著成效，但其治疗窗口期窄，且无法有效阻止继发性脑损伤的进展[5-6]。因此，寻找能够干预IS病理级联反应、促进神经功能恢复的有效药物，仍是当前神经科学领域的研究热点和挑战。

中医药在卒中治疗中积累了丰富的临床经验。补阳还五汤是治疗中风后遗症的经典名方，以益气活血为核心治则，临床应用广泛且疗效显著[7-8]。黄芪作为该方剂中的君药，发挥着至关重要的作用。黄芪甲苷（astragaloside IV，AS-IV）是黄芪中含量最高、活性最强的皂苷类单体成分 [9]。现代药理学研究已证实，AS-IV具有广泛的生物学活性，包括抗炎（如通过调控NF-κB介导的炎症）和抗氧化（如激活Nrf2/ARE通路）等，并在多种神经系统疾病模型中展现出神经保护作用[10-13]。多项研究进一步表明，AS-IV能够有效减轻大鼠中脑动脉闭塞模型所致的脑梗死体积和神经功能缺损，其机制可能与抑制小胶质细胞活化、减轻氧化应激损伤及调控自噬等有关[14-16]。然而，中药成分具有多靶点、多通路的复杂作用特征，目前AS-IV治疗IS的分子机制尚未完全阐明，一定程度上限制了其开发和应用。因此，本研究拟采用网络药理学方法，系统筛选AS-IV治疗IS的潜在作用靶点和信号通路，并运用分子对接技术验证AS-IV与核心靶点的结合能力，最后通过建立体外神经元氧糖剥夺/复糖复氧（oxygen-glucose deprivation/reoxygenation，OGD/R）损伤模型，对预测的关键信号通路进行实验验证，旨在从“整体-局部-分子”多个层面系统揭示AS-IV治疗IS的分子机制，为其临床应用和新药研发提供参考依据。

1 资料与方法

1.1 实验细胞株

人神经母细胞瘤细胞株SH-SY5Y（批号：CL-0208，武汉普诺赛生命科技有限公司）。

1.2 药物和试剂

黄芪甲苷（纯度：≥98%，批号：HY-N0431R，MedChemExpress）；重组人TNF-α激动剂（纯度：≥98%，批号：HY-P70426G，Selleck Chemicals）；依那西普（纯度：≥98%，批号：HY-108847，Selleck Chemicals）。

Advanced qPCR SYBR Master Mix（批号：11185ES08，翌圣生物科技（上海）股份有限公司）；甘油醛-3-磷酸脱氢酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）、肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、核因子-κB（nuclear factor-κB，NF-κB）、B细胞淋巴瘤-2（B-cell lymphoma-2，BCL-2）、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3（cysteine aspartate protease-3，Caspase-3）、白细胞介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）、白细胞介素-6（interleukin-6，IL-6）抗体（批号分别为10375 -2-AP、17590-1-AP、1-220aa、26593-1-AP、163-175aa、16806-1-AP、1-212aa，武汉三鹰生物技术有限公司）。TNF-α、IL-6、IL-1β ELISA试剂（批号分别为EZHTNFA-150K、EZIL-6、RAB0273，默克生命科学技术（南通）有限公司）。

1.3 仪器

CO细胞培养箱（美国Thermo Fisher Scientific公司）；SynergyH1型多功能酶标仪（美国BioTek公司）；Applied Biosystems QuantStudio 5型荧光定量PCR仪（美国Thermo Fisher Scientific公司）；ChemiDoc XRS+型化学发光成像分析仪（美国Bio-Rad公司）；5424R型高速冷冻离心机（德国Eppendorf公司）。

1.4 网络药理学及分子对接分析

1.4.1 AS-IV靶点筛选

以“Astragaloside IV”作为核心检索词，通过检索Comparative Toxicogenomics Database（https://ctdbase_org.hnucm.opac.vip/）、SwissTargetPrediction（http://www.swisstargetprediction.ch/）和PharmMapper（http://www.lilab-ecust.cn/pharmmapper/）数据库获取AS-IV的潜在药理作用靶点，并利用UniProt数据库（https://www.uniprot.org/）的官方基因符号进行标准化统一，将其汇总到Microsoft Excel 16.0软件中剔除重复条目，最终构建AS-IV潜在作用靶点集合。

1.4.2 IS疾病靶点筛选

在GeneCards（https://www.genecards.org/）、DisGeNET（https://www.disgenet.org/）及OMIM数据库（https://www.omim.org/）中以“Ischemic Stroke”作为核心检索词，将检索到的与IS相关的基因靶点进行汇总，并依据官方基因符号进行标准化处理，将其汇总到Microsoft Excel 16.0软件中去除重复项，从而获得IS疾病相关靶点集合。

1.4.3 AS-IV靶点与IS疾病相关靶点交集

借助在线生物信息学工具Venny 2.1（https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/）筛选AS-IV治疗IS的关键潜在靶点，并汇总前述构建的AS-IV潜在作用靶点与IS疾病相关靶点，筛选出二者的交集靶点，最后利用Venny 2.1的可视化功能生成Venn图。

1.4.4 构建AS-IV-IS疾病靶点的蛋白质-蛋白质相互作用网络

将交集靶点上传至STRING数据库（https://string-db.org/），将物种严格限定为“Homo sapiens”，并采用中等置信度（medium confidence score）＞0.4作为蛋白质间相互作用的筛选阈值。基于数据库中已知和预测的蛋白质相互作用信息，构建蛋白质-蛋白质相互作用（protein-protein interaction，PPI）网络。最后，导出高分辨率的PPI网络图以及节点（蛋白质）与边（相互作用）信息的TSV格式文件，以供后续深入分析。

1.4.5 构建AS-IV-IS疾病靶点的核心网络图

将STRING数据库导出的TSV格式文件导入Cytoscape 3.9.1软件，从复杂的PPI网络中识别出居于核心调控地位的关键靶点。利用其内置的CytoHubba插件，采用度（Degree）拓扑算法对网络中的所有节点进行重要性评估。依据度值从高到低对所有靶点进行排序，筛选出排名前10位的靶点作为AS-IV治疗IS的核心靶点。同时，对核心网络进行可视化，图谱中节点的颜色深度与度值大小呈正相关，从而直观展示核心靶点的拓扑重要性。

1.4.6 基因本体论功能和京都基因与基因组百科全书通路富集分析

将共同靶点基因列表提交至功能注释和富集分析数据库DAVID（https://david.ncifcrf.gov/），以人类全基因组为背景，分别进行基因本体论（Gene Ontology，GO）富集分析和京都基因与基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）通路富集分析。GO分析从生物过程（bioogical process，BP）、细胞组分（cellular component，CC）和分子功能（molecular function，MF）3个维度阐释靶点功能。KEGG分析则用于识别这些靶点显著参与的信号通路。设定校正后的P值（Adjusted P-value）＜0.05作为富集显著性的阈值。按照P值由小到大的顺序对富集结果进行排序，并选取排名前20的GO条目和KEGG通路，借助生物信息学在线绘图平台（http://www.bioinformatics.com.cn/）的可视化功能，将结果以气泡图的形式呈现，图中气泡的大小代表富集到的基因数量，颜色代表P值的大小。

1.4.7 分子对接

从PDB数据库（https://www.rcsb.org/）下载排名前10的核心靶点蛋白高分辨率三维晶体结构，经PyMOL 2.5和AutoDockTools 1.5.6软件预处理（移除水分子、杂原子等，加氢并计算电荷），生成PDBQT格式受体文件。从PubChem数据库（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）获取AS-IV三维结构，经Chem3D能量最小化得到稳定构象作为配体文件。随后利用AutoDock Vina 1.2.5软件在靶蛋白活性口袋周围设置格点盒子进行柔性对接，输出结合能信息。结合能绝对值越大，表明结合越稳定。选取最低结合能构象为最佳模式，最后通过PyMOL 2.5软件可视化分析AS-IV与靶蛋白活性位点氨基酸残基的氢键、疏水作用等相互作用力。

1.5 实验验证

1.5.1 细胞培养与OGD/R模型建立

将人神经母细胞瘤细胞株（SH-SY5Y）置于含10%胎牛血清及1%青霉素-链霉素双抗溶液的DMEM高糖培养基中，置于37 ℃、5%  CO₂饱和湿度的恒温培养箱内进行常规培养与传代。待细胞生长至对数期且融合度达到70%~80%时，用于OGD/R损伤模型。具体操作：首先弃去原培养基，用PBS缓冲液清洗细胞两次，随后换用无糖DMEM培养基，并将细胞置于三气培养箱（1%  O₂，5%  CO₂，94% N₂）中进行缺氧缺糖处理4 h。缺氧处理结束后，迅速将培养板取出，更换为正常的含血清高糖培养基，并转入常规培养箱中复糖复氧培养24 h，以模拟脑缺血再灌注后的病理生理过程[17]。

1.5.2 不同浓度AS-IV、TNF抑制剂及TNF激动剂对细胞存活率的影响

采用CCK-8法检测药物对SH-SY5Y细胞存活率的影响，以确定后续实验中各药物的安全有效浓度。取对数生长期细胞，调整密度后接种于96孔板中，待细胞贴壁后，分别设置不同浓度梯度的AS-IV（10 μg/mL、20 μg/mL、40 μg/mL、80 μg/mL、160 μg/mL）、TNF抑制剂（依那西普，Etanercept；25 ng/mL、50 ng/mL、100 ng/mL、200 ng/mL、400 ng/mL）以及TNF激动剂（重组人TNF-α；5 ng/mL、10 ng/mL、20 ng/mL、40 ng/mL、80 ng/mL）实验组[18-20]，并设空白对照组，每组设4个复孔。药物干预24 h后，每孔加入10 μL CCK-8溶液，继续在培养箱中孵育2 h，使用多功能酶标仪在450 nm波长处测定各孔的光密度值。根据光密度值计算细胞存活率，并据此筛选出对细胞无明显毒性且具有潜在活性的药物浓度范围，用于后续的分组干预实验。

1.5.3 实验分组及干预

根据CCK-8实验结果，选取合适的药物浓度进行后续机制验证实验。实验共分为6 组：①空白对照组（Control）：仅进行常规培养，不作任何处理；②模型组（OGD/R）：仅进行OGD/R处理；③AS-IV低、中、高剂量组（AS-IV-L/M/H）：在OGD/R处理后的复糖复氧阶段，分别加入终浓度为20 μg/mL、40 μg/mL、80 μg/mL的AS-IV进行干预；④TNF抑制剂组：在复糖复氧阶段，加入终浓度为100 ng/mL的依那西普作为阳性对照；⑤AS-IV中剂量+TNF激动剂组：在复糖复氧阶段，同时加入40 μg/mL的AS-IV和20 ng/mL的重组人TNF-α进行干预。所有药物均与细胞共培养24  h后，收集细胞或细胞上清液用于后续指标检测。

1.5.4 RT-qPCR实验检测mRNA表达

药物干预24 h后，采用Trizol法提取细胞总RNA，并使用微量分光光度计测定其浓度与纯度。取1 μg总RNA，按照逆转录试剂盒说明书将其逆转录为cDNA。随后，以合成的cDNA为模板，使用SYBR Green Master Mix在实时荧光定量PCR仪上进行扩增。依据试剂说明书，将反应程序设置为94 ℃预变性3 min，然后进行40个循环（94 ℃变性15 s，60 ℃退火延伸30 s）。实验检测的核心靶基因包括TNF、NF-κB、IL-6、Caspase-3、IL-1β和BCL2，并以GAPDH作为内参基因进行校正。所有实验重复3次，采用2-ΔΔCt法计算各靶基因的相对mRNA表达水平。引物序列见表1。

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  表格1 引物序列

  Table 1.Primer sequence

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1.5.5 Western blot实验检测蛋白表达

收集各组细胞，加入含有蛋白酶抑制剂的RIPA裂解液进行冰上裂解，提取总蛋白并通过BCA法进行定量。取等量蛋白样品进行SDS-PAGE凝胶电泳，随后将分离的蛋白转移至PVDF膜上。使用5%脱脂牛奶室温封闭1 h后，分别加入TNF、NF-κB、IL-6、Caspase-3、IL-1β、BCL2以及内参GAPDH的一抗，在4℃条件下孵育过夜。次日，经TBST洗膜后，加入辣根过氧化物酶（HRP）标记的相应二抗室温孵育1 h。最后，使用ECL化学发光底物进行显影，并通过化学发光成像系统采集图像。利用Image J 1.54p软件对目的条带的灰度值进行半定量分析，计算各蛋白的相对表达量。

1.5.6 TNF-α、IL-6、IL-1β的水平检测

在各组细胞干预培养24 h后，小心吸取细胞培养上清液，并于4 ℃下离心以去除细胞碎片。采用ELISA法进行检测，严格按照人源TNF-α、IL-6和IL-1β ELISA试剂盒的说明书进行操作。使用酶标仪在相应波长处测定各孔的吸光值，并根据标准曲线计算出上清液中各种细胞因子的精确浓度（pg/mL）。

1.5.7 统计分析

所有实验数据均采用SPSS 26.0统计软件进行处理与分析，计量资料以均数和标准差（）的形式表示。多组间的均数比较采用单因素方差分析。若方差齐性检验结果显示方差齐，则组间两两比较采用LSD-t检验；若方差不齐，则采用Dunnett's T3检验。P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 网络药理学及分子对接结果

2.1.1 AS-IV与IS靶点交集分析

将371个AS-IV潜在作用靶点与121个IS疾病相关靶点导入Venny 2.1工具进行交集分析，结果显示，药物与疾病的交集靶点数量为41个，见图1。

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  图1 黄芪甲苷与缺血性脑卒中交集靶点的Venn图

  Figure 1.Venn diagram of the intersection targets of astragaloside IV and ischemic stroke

  注：AS-IV，astragaloside IV，黄芪甲苷；IS，ischemic stroke，缺血性脑卒中。

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2.1.2 AS-IV与IS交集靶点的PPI网络

为探究41个交集靶点之间的相互作用关系，将其导入STRING数据库并构建PPI网络。该网络由41个节点和464条边组成，网络的平均节点度为22.6，表明这些靶蛋白之间形成了紧密且复杂的调控网络，见图2。

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  图2 黄芪甲苷与缺血性脑卒中交集靶点的蛋白质-蛋白质相互作用网络图

  Figure 2.Protein-protein interaction network of the intersection targets for astragaloside IV and ischemic stroke

  注：图中每个节点代表一个交集靶点蛋白，节点之间的连线代表蛋白间的相互作用关系。节点的大小和颜色深度与其在网络中的度值呈正相关，连线的粗细代表相互作用置信度的高低。

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2.1.3 AS-IV-IS疾病靶点的核心网络图

将PPI网络数据导入Cytoscape软件，利用CytoHubba插件的拓扑分析功能，依据度（degree）值对节点的重要性进行排序。筛选出网络中排名前10位的关键靶点，分别为BCL2、IL-6、TNF、IL-1β、PPARG、Caspase-3、MMP9、HSP90AA1、ESR1及AKT1，见图3。

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  图3 黄芪甲苷与缺血性脑卒中交集靶点的核心网络图

  Figure 3.Core network diagram of the intersection targets for astragaloside IV and ischemic stroke

  注：节点颜色越深，代表其度值越高。

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2.1.4 GO和KEGG富集分析

GO分析结果显示，在BP层面，靶点主要富集于PI3K/AKT信号通路的正向调控、凋亡过程的负向调控、细胞群体增殖的正向调控及炎症反应等；在CC层面，主要涉及膜筏、细胞质、线粒体及细胞核等；在MF层面，主要与同种蛋白结合、酶结合及蛋白激酶活性等相关。KEGG通路富集分析结果表明，这些靶点显著富集于NF-κB信号通路、血脂与动脉粥样硬化、AGE-RAGE信号通路、PI3K-AKT信号通路及凋亡通路等，见图4。

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  图4 黄芪甲苷与缺血性脑卒中交集靶点的基因本体论功能及京都基因与基因组百科全书通路富集分析气泡图

  Figure 4.Bubble charts of Gene Ontology functional and Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes pathway enrichment analysis for the intersection targets of astragaloside IV and ischemic stroke

  注：A. 生物过程；B. 细胞组分；C. 分子功能；D. 京都基因与基因组百科全书富集通路。

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2.1.5 分子对接结果

结果显示，AS-IV与排名前10 个核心靶点均表现出良好的结合能力，其结合能均低于-7.0  kcal/mol，提示两者之间能够形成稳定的复合物，见表2。通过Pymol软件对最佳对接构象进行可视化分析，可以发现AS-IV分子能够精准地嵌入靶蛋白的活性口袋中，并与周围的关键氨基酸残基形成多个氢键及疏水相互作用，见图5。

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  表格2 黄芪甲苷与核心靶点的结合能

  Table 2.Binding energy of astragaloside IV to core targets

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  图5 黄芪甲苷与核心靶点的分子对接可视化结果

  Figure 5.Visualization results of molecular docking between astragaloside IV and core targets

  注：A. 黄芪甲苷与TNF；B. 黄芪甲苷与IL-6；C. 黄芪甲苷与MMP9；D. 黄芪甲苷与PPARG；E. 黄芪甲苷与Caspase-3；F. 黄芪甲苷与ESR1；G. 黄芪甲苷与HSP90AA1；H. 黄芪甲苷与AKT1；I. 黄芪甲苷与BCL2；J. 黄芪甲苷与IL-1β。

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2.2 实验验证结果

2.2.1 不同浓度AS-IV、TNF抑制剂及TNF激动剂对细胞存活率的影响

CCK-8实验结果显示，与0 μg/mL AS-IV处理组相比，10 μg/mL浓度的AS-IV对SH-SY5Y细胞活力无显著影响（P＞0.05）；当浓度达到20 μg/mL时，细胞活力开始显著下降（P＜0.05），但细胞存活率仍大于80%。同样，在高于25 ng/mL的依那西普浓度范围外，TNF抑制剂对细胞活力具有显著影响；在高于5 ng/mL的重组人TNF-α浓度范围外，TNF激动剂对细胞活力具有显著影响。基于此实验结果，综合考虑细胞毒性及潜在治疗效果，本研究选取20 μg/mL、40 μg/mL、80 μg/mL作为AS-IV的低、中、高剂量组浓度，选取100 ng/mL作为TNF抑制剂组的干预浓度，选取20 ng/mL作为TNF激动剂组的干预浓度，用于后续机制验证实验，见图6。

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  图6 不同浓度黄芪甲苷、TNF抑制剂及TNF激动剂对细胞活力的影响（x ± s，n=3）

  Figure 6.Effects of different concentrations of AS-IV, TNF inhibitor and TNF agonist on cell viability (x ± s, n=3)

  注：A. 黄芪甲苷；B. TNF抑制剂；C. TNF激动剂。AS-IV，astragaloside IV，黄芪甲苷；与0 μg/mL药物浓度组比较，**P＜0.01。图中纵轴为细胞活力（%），横轴为各药物浓度。

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2.2.2 AS-IV对SH-SY5Y细胞相关mRNA表达水平的影响

RT-qPCR实验结果显示，与空白对照组相比，模型组中促炎及促凋亡相关基因TNF、NF-κB、IL-6、Caspase-3、IL-1β的mRNA表达水平均显著升高，抗凋亡基因BCL2的mRNA水平则显著降低（P＜0.01）。与模型组相比，AS-IV低、中、高剂量组及TNF抑制剂组均能显著下调TNF、NF-κB、IL-6、Caspase-3、IL-1β的mRNA表达水平，并显著上调BCL2的mRNA水平（P＜0.01），且AS-IV的效应呈现一定的剂量依赖性。值得注意的是，与AS-IV中剂量组相比，AS-IV中剂量+TNF激动剂组的保护作用被显著逆转，其TNF、NF-κB、IL-6、Caspase-3、IL-1β的mRNA水平显著回升，而BCL2的mRNA水平显著下降（P ＜0.01）。以上结果提示AS-IV可能通过调控上述基因的转录水平来发挥其对OGD/R损伤的神经保护作用，见图7。

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  图7 RT-qPCR检测各组细胞TNF、NF-κB、IL-6、Caspase-3、IL-1β、BCL2的mRNA表达水平（x ± s，n=3）

  Figure 7.The mRNA expression levels of TNF, NF-κB, IL-6, Caspase-3, IL-1β, and BCL2 in each group of cells were detected by RT-qPCR (x ± s, n=3)

  注：a. TNF mRNA表达水平；b. NF-κB mRNA表达水平；c. IL-6 mRNA表达水平；d. Caspase-3 mRNA表达水平；e. IL-1β mRNA表达水平；f.  BCL2 mRNA表达水平。与空白组相比，##P＜0.01；与模型组相比，**P＜0.01；与AS-IV中剂量组相比，$$P＜0.01。A为空白组，B为模型组，C为AS-IV低剂量组，D为AS-IV中剂量组，E为AS-IV高剂量组，F为TNF抑制剂组，G为AS-IV中剂量+TNF激动剂组。

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2.2.3 AS-IV对SH-SY5Y细胞相关蛋白表达的影响

结果表明，与空白对照组相比，模型组细胞中TNF、NF-κB、IL-6、Caspase-3、IL-1β蛋白的表达显著上调，而BCL-2蛋白的表达显著下调（P＜0.01）。经AS-IV低、中、高剂量或TNF抑制剂干预后，上述促炎、促凋亡蛋白的表达水平均被显著抑制，抗凋亡蛋白BCL-2的表达则显著增强（P＜0.01），其效果与mRNA水平的变化趋势一致。TNF激动剂的加入显著削弱了AS-IV中剂量组的保护效应，导致TNF、NF-κB等蛋白表达水平相较于单纯中剂量组显著回升，而BCL-2表达则被抑制（P＜0.01）。这表明AS-IV的神经保护作用与其对这些关键蛋白表达的调控密切相关，见图8。

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  图8 Western blot实验检测各组细胞中TNF、NF-κB、IL-6、Caspase-3、IL-1β、BCL2蛋白表达水平（x ± s，n=3）

  Figure 8.Western blot was used to detect the protein contents of TNF, NF-κB, IL-6, Caspase-3, IL-1β, and BCL2 in each group of cells (x ± s, n=3)

  注：a. 蛋白条带图；b. TNF蛋白表达水平；c. NF-κB蛋白表达水平；d. IL-6蛋白表达水平；e. Caspase-3蛋白表达水平；f. IL-1β蛋白表达水平；g. BCL2蛋白表达水平。

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2.2.4 各组细胞中TNF-α、IL-6、IL-1β的表达水平

与空白对照组相比，模型组上清液中TNF-α、IL-6、IL-1β的浓度显著升高（P＜0.01），表明OGD/R成功诱导了细胞的炎症反应。与模型组相比，AS-IV低、中、高剂量和TNF抑制剂均能显著降低这三种炎症因子的分泌水平（P＜0.01），从而有效抑制炎症。当TNF激动剂与AS-IV中剂量共同作用时，上清液中TNF-α、IL-6、IL-1β的浓度相较于单纯AS-IV中剂量组显著升高（P＜0.01），进一步证实了AS-IV的抗炎作用与对TNF信号通路的抑制有关，见图9。

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  图9 ELISA法检测各组细胞上清液中TNF-α、IL-6、IL-1β的表达水平（x ± s，n=3）

  Figure 9.The expression levels of TNF-α, IL-6, and IL-1β in the supernatant of each group of cells were detected by ELISA (x ± s, n=3)

  注：a. TNF-α表达水平；b. IL-6表达水平；c. IL-1β表达水平。

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3 讨论

IS后复杂的病理生理过程为药物开发带来了巨大挑战，而针对单一靶点的药物往往难以取得理想的治疗效果。中药活性成分因其多靶点、多途径的整合调节特性，在治疗IS等复杂疾病方面展现出独特优势。本研究综合运用网络药理学、分子对接和实验验证方法，系统探讨了黄芪主要活性成分AS-IV治疗IS的作用机制。

本研究通过网络药理学分析筛选出10个核心靶点，这些靶点参与了IS的核心病理环节——神经炎症和细胞凋亡[21]。脑缺血后，小胶质细胞和星形胶质细胞大量释放TNF-α、IL-1β和IL-6等促炎细胞因子，形成瀑布式的炎症级联反应，加剧脑组织损伤[22-25]。同时，缺血缺氧诱导的氧化应激会触发细胞凋亡，其中BCL-2和Caspase-3之间的失衡是关键调控节点[26-27]。AKT1作为PI3K/AKT信号通路的核心分子，是促进细胞存活、抑制凋亡的重要激酶[28]。AS-IV能够同时作用于这些炎症和凋亡网络中的多个关键节点，体现了其“整合调节”的潜力。

KEGG富集分析进一步将这些离散的靶点关联到具体的信号通路上，结果提示NF-κB信号通路是AS-IV发挥作用的核心枢纽。在静息状态下，NF-κB与抑制蛋白IκB结合在胞质中[29-30]。当受到TNF-α等刺激时，IκB激酶被激活，导致IκB磷酸化降解，从而释放NF-κB。活化的NF-κB启动下游大量促炎（包括TNF、IL-1β、IL-6等）和促凋亡基因的转录[31-32]。这种由TNF-α激活NF-κB，NF-κB再促进TNF-α等炎症因子产生的正反馈循环，是神经炎症持续和放大的关键机制 [33]。AS-IV可能通过干预这一恶性循环来发挥神经保护作用。

本研究体外实验结果验证了上述预测。通过成功建立OGD/R模型，模拟了IS的体外病理过程，发现神经元中炎症和凋亡指标显著升高。AS-IV的干预显著抑制了OGD/R诱导的TNF-α、IL-6、IL-1β的表达，并下调了NF-κB和Caspase-3的水平，上调了BCL-2的水平，这与既往关于AS-IV抗炎抗凋亡的研究结果一致[34]。最为关键的证据来自“挽救实验”：当外源性添加TNF-α激动剂后，AS-IV的保护作用被显著削弱。这直接表明TNF-α是AS-IV发挥作用的关键上游靶点，AS-IV通过抑制TNF-α及其介导的下游NF-κB信号通路，阻断了炎症和凋亡的级联反应。分子对接结果也从原子层面支持了AS-IV与TNF等核心靶点直接结合的可能性，为其抑制靶点功能提供了结构生物学基础。现有研究也证实了AS-IV对IS的治疗作用，如AS-IV可抑制NF-κB核转位以降低TNF-α、IL-1β水平[35]，与本研究体外下调NF-κB、减少炎症因子的结果一致。Zhang等的研究发现，AS-IV通过Nrf2/HO-1通路间接抑制NF-κB[36]。本研究GO分析也提示其靶点涉及抗氧化相关过程，表明AS-IV可能通过多通路协同抗炎。在凋亡调控上，Shi等在原代神经元模型中发现AS-IV通过激活PI3K/Akt/mTOR信号通路促进小鼠局灶性缺血性中风后的脑血管生成和神经恢复[37]。上述研究虽揭示了AS-IV的部分作用通路，但均未明确其调控NF-κB的上游核心靶点。本研究进一步通过实验验证了TNF是AS-IV调控NF-κB通路的上游关键靶点，说明TNF/NF-κB信号通路是有效减轻神经炎症和细胞凋亡的关键环节。

本研究也存在一些局限性：首先，网络药理学的预测结果依赖于现有数据库的完整性和准确性；其次，缺乏体内实验验证，SH-SY5Y细胞系作为肿瘤细胞系来源的神经元模型，其响应可能与原代神经元存在差异，无法完全模拟体内复杂的细胞互作环境，特别是与胶质细胞、血管内皮细胞的相互作用。未来研究应在动物模型的基础上进一步验证AS-IV的体内药效及其对TNF/NF-κB通路的调控作用，并结合多组学技术，更全面地绘制AS-IV干预IS的调控网络。

综上所述，本研究采用整合药理学策略系统揭示了AS-IV治疗IS的作用机制。研究发现，AS-IV通过多靶点协同作用，抑制了由TNF-α介导的NF-κB信号通路的激活，从而有效减轻神经炎症和细胞凋亡，发挥保护神经的作用。本研究为深入理解补阳还五汤治疗中风的科学内涵提供了分子层面的证据，并为进一步探索探究AS-IV在脑卒中治疗中的应用潜力提供了依 据。

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