目的   探究白细胞介素-37（interleukin-37，IL-37）炎症抑制因子对HepG2肝癌细胞增殖、凋亡和周期的影响。

方法  将IL-37的慢病毒表达载体pCDH-CMV-MCS-IL37-copGFP-T2A-Puro（pCDH-IL-37组）与空白载体pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP-T2A-Puro（pCDH组）分为实验组与对照组，分别对两组进行病毒包装与嘌呤霉素筛选，然后转染入体外培养的HepG2细胞。通过实时荧光定量逆转录聚合酶链反应（quantitative real-time reverse transcription polymerase chain reaction，RT-qPCR）检测转染后的HepG2细胞中的IL-37 mRNA表达水平。通过细胞计数试剂盒-8（cell counting kit-8，CCK- 8）法检测IL-37对HepG2细胞增殖的影响。通过流式细胞术检测IL-37对HepG2细胞周期及凋亡的影响。

结果  经过慢病毒包装、感染和嘌呤霉素筛选，荧光显微镜显示慢病毒表达载体成功转染到HepG2细胞中。RT-qPCR结果显示，HepG2细胞中IL-37相对表达水平高。CCK-8法检测结果显示，细胞培养24 h、48 h、72 h后，与pCDH组比较，pCDH-IL-37组细胞450 nm波长处的光密度（optical density，OD），即OD450，吸光值明显降低，差异具有统计学意义（P＜0.001），且随着培养时间的延长，细胞存活率逐渐降低。流式细胞术检测细胞周期结果显示，与pCDH组比较，pCDH-IL-37组的S期细胞比率显著降低，G1期细胞比率显著升高，细胞周期被阻滞于G1期。流式细胞术检测细胞凋亡结果显示，pCDH-IL-37组的细胞凋亡率显著高于pCDH组（9.833%±0.252% vs. 4.867%±0.569%，P＜0.001）。RT-qPCR结果显示，pCDH-IL-37组Caspase-3与Fas的mRNA表达水平降低，表明IL-37对Caspase-3与Fas诱导的凋亡可能具有抵抗作用。

结论  IL-37在体外可以直接抑制肝癌细胞HepG2的增殖，促进其凋亡，将细胞周期阻滞在G1期，并可能通过下调Caspase-3与Fas的表达，对Caspase-3与Fas诱导的凋亡发挥抵抗作用。

原发性肝癌（primary liver cancer，PLC）是人类第六大常见恶性肿瘤，居全球癌症相关死亡的第三位[1]。肝细胞肝癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是PLC的主要病理类型，约占PLC的80%~85%，是全球面临的一项重大公共健康问题[2]。由于HCC的恶性程度极高，瘤体在肝脏内隐匿生长，确诊时绝大多数患者往往已处于疾病晚期，错过了最佳治疗时机[3]。近十年来，慢性炎症刺激在HCC的发生发展中发挥的关键作用已得到广泛证实[4-7]。持续的病毒感染与肝脏的持续损伤和再生有关，从而导致肝纤维化、肝硬化，最终发展为 HCC。我国HCC患者中由乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）感染引起的比例高达86%，慢性HBV感染导致的肝纤维化和肝硬化是我国HCC的主要病因[8]。因此，监测候选血清生物标志物是早期诊断、复发监测、预后评估和选择HCC治疗方法的有效途径。

白细胞介素-37（interleukin 37，IL-37）是白细胞介素-1（interleukin 1，IL-1）家族的成员之一，可通过强大的抗炎抗肿瘤作用在感染性疾病、过敏性疾病、代谢性疾病、自身免疫性疾病和肿瘤发展过程中发挥重要保护作用[9- 11]。既往研究发现，IL-37主要通过参与肿瘤微环境的免疫调节，抑制肿瘤生长、血管生成及肿瘤细胞的迁移、侵袭和转移来发挥抗癌作用 [11]。然而，IL-37在HCC中的分子机制尚不清楚。研究发现，过表达IL-37的人肝癌细胞Hep3B在体外可以募集更多的自然杀伤细胞（natural killer cell，NK），IL-37在体内可通过调节CD57+NK细胞的先天免疫作用介导肝细胞癌的抗肿瘤活性 [12]。Liu等在人肝癌细胞SMMC-7721和HepG2细胞中发现，过表达IL-37通过将HCC限制在G2/M细胞周期而显著抑制肿瘤生长，但活细胞数量的减少不能归因于诱导凋亡，而是通过将磷酸化母亲DPP同源物3（phosphorylated mothers against decapentaplegic homolog 3，pSmad3）信号从c-Jun氨基末端激酶（c-Jun N-terminal kinase，JNK） /连接区磷酸化的Smad3（linker-phosphorylated Smad3，pSmad3L）/骨髓细胞瘤癌（cellular-myelocytomatosis oncogene gene，c-Myc）的致癌信号转化为C-末端磷酸化的Smad3（C-terminally phosphorylated Smad3，pSmad3C）/P21的肿瘤抑制信号来抑制肝细胞肿瘤的生长[13]。Li等的研究发现，IL-37抑制了HepG2细胞的增殖，并可通过抑制磷酯酰肌醇-3-激酶（phosphatidylinositol 3 kinase，PI3K）/蛋白激酶B（protein kinase B，AKT）/雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）通路诱导人肝癌细胞SMMC-7721和Huh-7细胞的自噬与凋亡[14]。表达IL-37的牛痘病毒对人肝癌细胞HepG2、HCCLM3、SMMC7721与Bel7402HCC细胞均具有体外细胞毒作用[15]，被表达IL-37的牛痘病毒感染后，信号转导和转录激活因子3（signal transducer and activator of transcription3，STAT3）的磷酸化水平降低，表明STAT3与HCC细胞的增殖、迁移和侵袭密切相关。Li等发现IL-37在HCC组织和人肝癌细胞HepG2与MHCC97H中的表达降低 [16]。Guo等发现在HepG2与MHCC97H细胞中，IL-37可能通过抑制白细胞介素-6（interleukin-6，IL-6）/八聚体结合转录因子4（octamer-binding transcription factor 4，Oct4）途径抑制HCC的发展[17]。IL-37在人肝癌细胞SMMC 7721中通过调节肿瘤细胞在肿瘤微环境中促血管生成和抗血管生成因子的表达来发挥抗血管生成作用[18]。上述研究大多数能证明IL-37可通过抑制细胞增殖来阻止HCC的发生，但在诱导细胞凋亡和周期阻滞方面仍存在不确定性，因此，本研究通过体外过表达细胞系，初步探讨IL-37对人肝癌HepG2细胞增殖、周期及凋亡的影响。

1 资料与方法

1.1 载体资料

人IL-37重组慢病毒表达载体为pCDH-CMV-MCS-IL37-copGFP-T2A-Puro，对照载体为pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP-T2A-puro，分别作为实验组（pCDH-IL-37组）和对照组（pCDH组）。两种载体均购自广州IGE生物科技有限公司，psPAX2和pMD2G质粒购自美国ThermoFisher Scientific。

1.2 细胞培养

人HepG2细胞系和人HEK293T细胞系来源于中国科学院上海细胞生物学研究所模式培养细胞库。HepG2细胞和HEK293T细胞在含有10%胎牛血清（Gibco）的DMEM培养基（Gibco）中，37℃，5% CO2培养。

1.3 慢病毒包装和细胞系的建立

按照试剂说明书，使用polybren（Polysciences）将pCDH-IL-37或pCDH的载体质粒、pSPAX2、pMD2G三质粒共转染293 T细胞。72 h后收集病毒上清，并通过超速离心得到高滴度的慢病毒保存液，pCDH-IL-37和pCDH滴度均为1×10⁹  TU/ mL。分别使用含pCDH- IL-37质粒与pCDH质粒的病毒液感染人肝癌细胞系HepG2，在5 mg/mL聚乙烯（Sigma）存在下，感染复数（multiplicity of infection，MOI）为30。感染72 h后，用2 µg/mL嘌呤霉素筛选细胞，建立稳定的细胞系。

1.4 反转录和实时荧光定量聚合酶链式反应

采用高纯总RNA快速提取试剂盒（BioTeke）提取培养细胞总RNA，用紫外分光光度计测定260 nm/280 nm 的吸光度值，计算RNA的浓度和纯度。按照HiScript II Q RT SuperMix for qPCR （+gDNA wiper）试剂盒（Vazyme）说明书对总RNA进行逆转录合成cDNA。以cDNA 为模板，20 µL体系中加入下列组分：Hieff ^®qPCR SYBR^® Green Master Mix（Low Rox Plus）反应混合液10.0 µL，上游引物0.8 μL，下游引物0.8  μL，ddH₂O 7.4 μL和 cDNA 1 μL。IL-37上游引物：5'-TTCTTTGCATTAGCCTCATCCTT-3'，下游引物：5'-CGTGCTGATTCCTTTTGGGC-3'，扩增片段长度182 bp；Fas上游引物：5'- CTTCCCATCCTCCTGACCACCG-3'，下游引物：5'-TCACTCGTAAACCGCTTCCCTC-3'，扩增片段长度 117 bp；Caspase-3上游引物：5'-GGACTGTGGCATTGAGACAGA-3'，下游引物：5'-TCAAGCTTGTCGGCATACTGT-3'，扩增片段长度189 bp ；GAPDH上游引物：5'-AACGGATTTGGTCGTATTGGG-3'，下游引物：5'-CCTGGAAGATGGTGATGGGAT-3'，扩增片段长度211 bp。反应条件：94℃预变性1 min，然后94℃ 15 s、60℃20 s、72℃ 20 s，40个循环后4℃保持。将IL-37、Fas与Caspase-3的表达量归一化为内参GAPDH，采用比较阈值循环(2-ΔΔCt)法计算IL-37、Fas与Caspase-3 mRNA的相对表达量。

1.5 细胞计数试剂盒-8实验

使用细胞计数试剂盒-8（cell counting kit- 8，CCK-8）（Beyotime）按照说明书检测细胞增殖能力。细胞在96孔板中分别培养4 h、24  h、48  h和72 h，再向每孔（100 μL）加入10  μL CCK-8试剂，细胞孵育2 h，记录450 nm处吸光值（OD450）。实验组细胞存活率=[（实验孔OD450-空白孔OD450）/（对照组OD450-空白孔OD450）]×100%。实验重复3次。

1.6 细胞周期实验

细胞接种于6孔培养板转染48 h后，收集细胞并用磷酸盐缓冲液（phosphate buffer solution，PBS）洗涤两次，然后加入预冷75%乙醇重悬，于-20 ℃固定过夜。加入PBS（含50 µg/mL碘化丙啶），100 µg/mL RNaseA，（0.2% Triton X-100）4 ℃避光孵育30 min。使用NovoCyte 2000R流式细胞仪（ACEA Biosciences） 检测4×10⁵个细胞，并使用NovoExpress 1.2.4软件进行分析，软件自动计算细胞处于G1期、S期和G2期的百分率。实验重复3次。

1.7 细胞凋亡实验

使用Annexin V-APC /7AAD kit试剂盒（杭州联科生物技术股份有限公司），按照说明书检测细胞凋亡情况。将生长良好的细胞用0.25%胰蛋白酶-EDTA消化后使用预冷PBS洗涤一次。以1×10⁵~1×106个细胞/mL的浓度在1×Binding Buffer中重悬。在100 µL的细胞悬液中加入5  µL Annexin V-APC和10 µL 7AAD，室温避光孵育15  min。然后加入485 µL预冷1×Binding Buffer，立即使用NovoCyte 2000R流式细胞仪（ACEA Biosciences）检测染色细胞的数量。在双变量流式分析的散点图上，左下象限为正常细胞（APC-/7AAD-），左上象限为坏死的细胞（APC-/7AAD+），右下象限为早期凋亡细胞（APC+/7AAD-），右上象限为晚期凋亡细胞（APC+/7AAD+）。使用NovoExpress 1.2.4软件进行数据分析，软件自动分别计算四象限细胞比率，细胞凋亡率为右下象限与右上象限比率之和。实验重复3次。

1.8 统计分析

应用SPSS 20.0软件进行数据分析。计量资料以均值和标准差（）表示，两组间比较采用独立样本t检验，以P＜0.05为差异有统计学意义（检验水准α＝0.05），多重比较使用Bonferroni校正，P＜0.05/N为差异有统计学意义（N为比较次数）。

2 结果

2.1 高表达IL-37的HepG2细胞建立与鉴定

病毒感染后的HepG2细胞在荧光显微镜下可观察到80%以上的细胞均有绿色荧光表达，说明重组慢病毒载体成功感染HepG2细胞，见图1-A、图1-B。分别提取两组细胞总RNA，采用实时荧光定量逆转录聚合酶链反应（quantitative real-time reverse transcription  polymerase chain reaction，RT-qPCR）检测两组细胞中IL-37 mRNA的相对表达量，结果显示，pCDH-IL-37组的IL-37 mRNA较 pCDH组显著上调（250.091±8.630 vs. 1.000±0.043，P=4×10-4），提示已建立稳定高表达IL-37 mRNA的HepG2细胞，见图1-C。

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  图1 高表达IL-37 mRNA的HepG2细胞的建立与鉴定

  Figure 1.Establishment and identification of HepG2 cells with high IL-37 mRNA expression

  注：A. pCDH组的绿色荧光表达情况（左：光镜，右：荧光显微镜）；B. pCDH-IL-37组的绿色荧光表达情况（左：光镜，右：荧光显微镜）；C. pCDH与pCDH-IL-37组的IL-37 mRNA相对定量情况，***P＜0.001。

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2.2 IL-37抑制HepG2细胞增殖

CCK-8检测结果显示，细胞培养4 h时，pCDH组与pCDH-IL-37组的OD450无明显差异。但在培养24 h后，与pCDH组相比，pCDH-IL-37组细胞的OD450明显降低（P＜0.001），见图 2-A。随着培养时间的延长，细胞存活率逐渐降低，见图2-B。说明提高HepG2细胞中IL-37的表达可抑制HepG2细胞的增殖，见表1、图2。

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  图2 IL-37可抑制HepG2细胞的增殖

  Figure 2.IL-37 inhibits the proliferation of HepG2 cells

  注：A. pCDH与pCDH-IL-37组4 h、24 h、48 h、72 h的OD450 nm吸光值比较，***P＜0.001；B. pCDH-IL-37组的细胞存活率。

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  表格1 pCDH组与pCDH-IL-37组OD450、凋亡率及细胞周期分布的比较（ x ± s）

  Table 1.Comparison of OD450, apoptosis rate and cell cycle distribution between pCDH group and pCDH-IL-37 group ( x ± s)

  注：CCK-8，cell counting kit-8，细胞计数试剂盒-8；OD，optical density，光密度。*表示与阈值（0.05/8=6.25×10-3，比较次数为8）比较具有显著差异。

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2.3 IL-37使细胞周期阻滞于第一间隙期

结果显示，pCDH-IL-37组中细胞第一间隙期（gap phase 1，G1期）细胞比率为（51.623%±0.548%），pCDH组G1期细胞比率为（45.683%±0.803%），差异有统计学意义（t=-10.586，P=4.510×10- 4）。pCDH-IL-37组细胞合成期（synthesisphase，S期）细胞比率为（36.327%±0.803%），pCDH组S期细胞比率为（40.627%±1.508%），差异有统计学意义（t=4.359，P=0.012）。与pCDH组相比，pCDH-IL-37组的S期细胞比率显著降低，G1期细胞比率显著升高，提示细胞周期被阻滞于G1期。因此上调HepG2细胞中IL-37的表达，可使细胞周期明显阻滞于G1期，S期细胞数目明显减少，细胞增殖受到抑制。见表1、图3。

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  图3 IL-37使HepG2的细胞周期阻滞在G1期

  Figure 3.IL-37 arrests the cell cycle of HepG2 in G1 phase

  注：A. pCDH组的细胞周期流式结果；B. pCDH-IL-37组的细胞周期流式结果；C. pCDH与pCDH-IL-37组的细胞周期分布情况比较，***P ＜0.001，*P＜0.05。

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2.4 IL-37促进HepG2细胞凋亡

为探讨IL-37诱导的细胞周期阻滞是否与细胞凋亡有关，使用流式细胞术检测pCDH组与pCDH-IL-37组的细胞凋亡差异。结果显示，在HepG2细胞中，pCDH组细胞凋亡率为（4.867%±0.569%），pCDH-IL-37组细胞凋亡率为（9.833%±0.252%），差异有统计学意义（t=- 13.834，P=1.580×10-4）；与pCDH组比较，pCDH-IL-37组的细胞凋亡率显著升高，见图4-A—图4-C。

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  图4 IL-37促进HepG2细胞凋亡并抵抗Caspase-3与Fas诱导的凋亡

  Figure 4.IL-37 promotes the apoptosis of HepG2 cells and resists the apoptosis induced by Caspase-3 and Fas

  注：A. pCDH组的细胞凋亡流式结果；B. pCDH-IL-37组的细胞凋亡流式结果；C. pCDH与pCDH-IL-37组的细胞凋亡情况比较；D. pCDH与pCDH-IL-37组的Caspase-3 mRNA表达情况比较；E. pCDH与pCDH-IL-37组的Fas mRNA表达情况比较；***P ＜0.001，**P＜0.01，*P ＜0.05。

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2.5 IL-37抵抗Caspase-3与Fas诱导的凋亡

为探讨IL-37促进细胞凋亡的作用机制，使用RT-qPCR法检测细胞Caspase-3 mRNA与Fas mRNA表达水平。结果显示，pCDH-IL-37组的Caspase-3 mRNA（0.564±0.182 vs. 1.000±0.153，P=0.034）与Fas mRNA（0.568±0.090 vs. 1.000± 0. 083，P=0.004）表达水平较pCDH组均明显降低，见图4-D、图4-E。

3 讨论

IL-37是一种能够有效抑制天然免疫和适应性免疫的新型细胞因子[19]。IL-37可显著抑制多种促炎因子，如IL-6、白细胞介素-12（interleukin-12，IL-12）、γ干扰素等的表达，并在多种炎症疾病发展过程中起重要作用[20-23]。除抗炎功能外，近年来，IL-37与肿瘤的关系备受关注。HCC是全球高发癌症之一，严重危害人类的健康。多数肝癌的发生始于HBV、丙型肝炎病毒感染或酒精和各种致癌物导致的肝脏炎症，其发生发展大多会经历肝炎-肝硬化-肝癌的转化过程。在HCC的发生发展中，慢性炎症是一个重要的促进因素 [4-7]，这预示着具有强大抗炎能力的IL-37可能对HCC的发生有潜在的调控功能，如预防病毒性肝炎、减轻肝损伤、靶向肝纤维化与调节免疫微环境等。既往研究表明，IL-37可通过抑制HepG2细胞增殖来阻止HCC的发生，但在诱导HepG2的细胞凋亡和周期阻滞方面尚未确定[13-14]。

本研究通过慢病毒包装系统（293T+ psPAX2+pMD2.G）对IL-37表达载体进行包装和感染筛选，最终获得高表达IL-37的HepG2细胞。采用CCK-8、碘化丙啶与Annexin V-APC/7AAD细胞凋亡检测试剂盒，探讨IL-37对人肝癌HepG2增殖、细胞周期和凋亡的影响，为进一步研究IL-37在HCC发生发展中的作用机制奠定了基础。CCK-8实验表明，高表达IL-37对细胞增殖的抑制作用明显强于对照细胞，与既往研究[13-14]结论一致，即IL-37可以抑制HepG2细胞的生长。

细胞周期内有两个阶段最为重要，即G1期到S期和G2期到M期。G1期是有丝分裂到DNA复制前的一段时期，在DNA合成之前。如果细胞周期在G1期被阻滞，细胞DNA合成和复制减少，增殖能力受到抑制。因此，本研究采用流式细胞术分析IL-37高表达细胞的DNA含量。本研究结果表明，G1期细胞数量明显增加，而S 期和G2期细胞数量减少，说明细胞被停滞在G1期，这可能意味着细胞的增殖能力受到抑制，导致细胞DNA合成和复制减少，这与CCK-8实验结果和IL-37的抗肿瘤作用相吻合。

细胞周期和细胞凋亡是细胞生命的两个基本过程，它们之间存在着复杂的相互作用。一方面，细胞凋亡可以导致细胞周期阻滞；另一方面，细胞周期的调控也可以影响细胞凋亡的发生 [24- 26]。本研究采用流式细胞术分析了细胞凋亡的变化，结果显示，IL-37可以显著促进HepG2细胞的凋亡，细胞凋亡率显著性增加，结合上述周期实验结果表明，IL-37诱导的HepG2细胞的凋亡可能与细胞周期阻滞有关。Li等的研究表明，IL-37可以诱导细胞的凋亡，包括SMMC-7721和Huh-7细胞[14]。然而，Liu等的研究表明，IL-37通过G2期而非G1期阻滞诱导细胞周期阻滞，活细胞数量的减少不能归因于诱导SMMC-7721和HepG2细胞的凋亡[13]。导致上述细胞周期阶段阻滞与细胞凋亡结果不一致的原因可能有两点：一是不同细胞株可能具有不同的细胞周期特征（如周期长度）；二是细胞中存在复杂的信号通路或基因调控网络，同一基因在不同细胞株中可能参与不同的信号通路或调控网络，因此，即使过表达同一基因在不同细胞株中可能也会引起不同的细胞响应，如细胞周期的不同调控，而不同的细胞周期调控可诱导细胞凋亡通路的激活[24-26]。

研究发现，许多信号通路激活了细胞凋亡通路[27]，细胞凋亡的通路主要包括线粒体通路和死亡受体通路，而诱导肿瘤细胞凋亡主要依赖线粒体通路[28]。因此，本研究还检测了与线粒体通路相关的凋亡激活特定蛋白酶Caspase-3、与死亡受体通路相关的Fas mRNA表达水平。结果显示，与pCDH组相比，pCDH-IL-37组的Caspase-3与Fas mRNA表达降低，提示IL-37对Caspase-3与Fas诱导的凋亡可能具有抵抗作用，可能通过其他的调控通路来进行其凋亡应答。

综上所述，本研究结果表明IL-37对HepG2细胞的影响是增殖抑制、细胞G1期阻滞、细胞凋亡增加，可能抵抗Caspase-3与Fas诱导的凋亡。因此，IL-37可能通过抑制细胞增殖、干扰细胞周期、减少DNA合成和复制与诱导细胞凋亡来介导抗HCC作用，或可成为HCC治疗的一个靶点。然而，其具体作用机制尚不清楚，且局限于较小的样本量，未来需要开展更大样本的研究，进一步深入探索IL-37是否参与HCC细胞的细胞周期和细胞凋亡的相互调控机制，以更好地理解HCC的发生与治疗。

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