目的  探究以人参茎叶总皂苷为原料，通过柠檬酸水解制备人参皂苷Rg5的最佳工艺。

方法  采取正交试验和Box-Behnken响应面法对料液比、柠檬酸浓度、反应时间和反应温度4个因素进行工艺优化，同时建立柠檬酸水解人参皂苷Rg5制备工艺的二次项数学模型，并验证其可靠性。

结果  经正交试验和Box-Behnken响应面法优化后，最佳工艺为料液比1 ∶ 21、柠檬酸浓度30%、反应时间3 h、反应温度95 ℃，此条件下人参皂苷Rg5平均得率为9.64%。

结论  经正交试验和Box-Behnken响应面法优化的工艺条件应用于人参皂苷Rg5的制备工艺转化效率较高，为人参稀有皂苷成分的开发利用提供了数据支撑。

人参作为传统的名贵中药材，在临床上已有近千年的应用历史[1]。科研工作者对其活性成分的研究逐渐明确，其主要化学成分广泛应用于医药、食品等领域，人参产业链不断延伸。在药食同源观念的推动下，随着产品市场供给侧比例的逐渐调整，消费者对于产品种类多元化的需求愈加凸显，以人参为原料的新型产品的市场份额也将随之增加[2]。人参皂苷作为人参中最重要的活性成分，一直被专家学者们所关注，由于植物体多年生的生长特性，其富集在人参的主要药用部位根茎中。近年来研究证实，人参茎叶中总皂苷的含量比根茎中更高，约为人参根茎中含量的2.16倍[3]。人参皂苷主要分为原生苷和次生苷，由于次生苷在植物体中含量极其稀少，且无法通过干预其生长过程获取，致使其价格居高不下，但由于其生物利用度和良好的药理活性，一直受到市场的青睐[4]。次级人参皂苷主要由原生皂苷通过催化剂进行结构修饰所得，转化过程涉及去除骨架结构达玛烷型四环三萜支链上所连糖基。人参皂苷Rg₅是具有较高活性的次级皂苷，可通过人参皂苷Rb1的去糖基化和人参皂苷Rg₃的20位碳脱水形成[5-6]。人参皂苷Rg₅在抗肿瘤、抗血栓、抗炎症、抗糖尿病、抗骨关节炎、提高免疫力、改善神经和心肌损伤等方面有显著的药理作用 [7-14]。目前，人参皂苷Rg₅的制备主要以加工人参、人参须根粉和原人参二醇组皂苷为原料，通过对其进行长时间高温高压或酸化处理进行制备，但制备时间长、耗能高、得率低、溶剂消耗大[15- 18]。本研究以人参茎叶总皂苷酸水解制备人参皂苷Rg₅，以期为人参皂苷广泛应用于市场及工业化生产提供前期试验和理论基础。

1 资料与方法

1.1 材料与试剂

人参茎叶总皂苷（吉林省宏久生物科技股份有限公司；纯度＞90.53%）；人参皂苷Rg₅（成都曼思特生物科技有限公司，纯度＞98.13%，批号：MUST-23020803）；乙腈（Fisher，色谱纯，批号：F22MB9201）；甲醇（Fisher，色谱纯，批号：221079）；硫酸（国药集团化学试剂有限公司，分析纯，批号：20230901）；香草醛（天津市光复科技发展有限公司，分析纯，纯度＞99%）；柠檬酸（北京化学试剂有限公司，分析纯，批号：20231011）；水为娃哈哈纯净水。

1.2 仪器设备

高效液相色谱仪（配有紫外检测器，OpenLAB CDS色谱工作站，美国安捷伦科技有限公司 Agilent-1260）；电子天平（赛多利斯科学仪器有限公司 SQP）；电子恒温水浴锅（金坛市白塔金昌实验仪器厂 HH-6）；超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司 KQ-300DE）；数显水浴恒温振荡器（常州市万丰仪器制造有限公司 WHY-2）；离心机（湖南湘仪实验室仪器开发有限公司 TDZ5-WS）；真空干燥箱（上海一恒科学仪器有限公司 DZF-6050）；紫外可见分光光度计（上海光谱仪器有限公司 SP-1920）。

1.3 试验方法

1.3.1 对照品溶液的制备

精密称定人参皂苷Rg₅标准品2.05 mg于1  mL容量瓶中，加色谱甲醇溶解并定容，制成2.05 mg/mL的人参皂苷Rg₅标准品溶液。取人参皂苷Rg₅标准品溶液100 μL，加色谱甲醇定容于1 mL容量瓶中，制成浓度为0.205 mg/mL的人参皂苷Rg₅对照品溶液。

1.3.2 供试品溶液的制备

精密称取人参茎叶总皂苷5.0 g，置于150  mL具塞三角瓶中，加入一定浓度的柠檬酸溶液，根据反应温度和反应时间设置水浴振荡器，将试验样品进行振荡后，超声处理附着在瓶壁的残留物，之后全部转移至离心瓶中，设置转速为

4 000 r/min，离心3 min，弃去上清液，加入超纯水100 mL，超声处理10 min，再重复上述离心等过程，共重复三次，用pH试纸检测上清液至中性后，弃去上清液，加入色谱甲醇15 mL，超声溶解后蒸至九成干，转移至真空干燥箱烘干，磨粉称重即得提取物质量M（g）。

精密称定供试品20 mg，置于10 mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，摇匀，即为供试品待测溶液。

1.3.3 色谱条件及方法学考察

色谱柱为Agilent ZORBAX SB-C18柱（4.6  mm×250 mm，5 μm）；检测波长为203  nm；柱温为30 ℃；体积流量为1.0 mL/min；进样量10  μL；流动相乙腈（A）：水（B）等度洗脱（0~60  min，46%A）。

采用高效液相色谱法（high performance liquid chromatography，HPLC）测定人参皂苷Rg₅含量，并通过线性关系考察、精密度考察、重复性试验、稳定性试验、加样回收试验进行方法学考察。① 线性关系：配制浓度分别为0.05  mg/ mL、0.1 mg/mL、0.2 mg/mL、0.3 mg/mL、0.4 mg/mL、0.5  mg/mL的标准系列溶液。按照1.3.3中的色谱条件检测方法，精密吸取上述不同浓度的混合标准溶液10  μL进行测定。以对照品浓度（mg/ mL）为横坐标，峰面积为纵坐标，进行线性回归计算，并绘制标准曲线。② 精密度：精密吸取同一对照品溶液6份，重复进样六次，记录人参皂苷Rg₅标样的峰面积，并计算相对标准偏差（relative standard deviation，RSD）。③ 重复性：精密称取同一批次的供试品6份，按照1.3.2中方法配制供试品溶液，按1.3.3中的测定方法分别进样检测，测定定量试样中人参皂苷Rg₅的峰面积，并计算RSD值。④稳定性：取同一供试品溶液，分别在放置0 h、2 h、4 h、8 h、16 h、24 h后按1.3.3中方法进样测定，记录峰面积，计算RSD值。⑤ 准确度： 取6份已知含量（见重复性实验）的供试品，每份约20 mg，每份加入人参皂苷Rg₅对照品1.0  mg。配制供试品溶液，测定样品中人参皂苷Rg₅的含量，并分别计算加样回收率。

1.3.4 人参皂苷Rg₅得率计算方法

以人参皂苷Rg₅得率为试验指标，计算公式如下：

其中Y为人参皂苷Rg₅得率（%），X为提取物中人参皂苷Rg₅的含量（mg/g）；M为提取物质量（g）；m为样品中总皂苷质量（g）。

1.4 试验设计

1.4.1 正交优化试验

根据人参茎叶总皂苷中皂苷的理化性质，选取水解制备过程中的料液比（A）、柠檬酸浓度（B）、反应时间（C）、反应温度（D）4个因素作为考察条件，每个因素设置3个水平，按L9（34）正交表设计试验方案，以人参皂苷Rg₅得率为试验指标，优化柠檬酸水解制备人参皂苷Rg₅的条件。

1.4.2 响应面优化试验

在正交试验的基础上，采用中心组合试验Box-Behnken设计模型试验（表1）。采用Design Expert 13软件按响应面法共设计29组试验，对料液比、柠檬酸浓度、反应时间、反应温度4 个因素进行条件优化，以人参皂苷Rg₅得率为响应面，确定因素之间的交互作用对人参皂苷Rg₅得率的影响，确定最优提取条件。

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  表格1 响应面试验因素水平设计表

  Table 1.Design table of factor levels for response surface experiments

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1.5 数据处理

通过数据处理系统（data processing system，DPS）设计正交试验，得出处理结果，采用Design Expert 13软件进行响应面设计及分析。

2 结果

2.1 高效液相色谱法分析

采用HPLC分析，结果见图1，人参茎叶总皂苷经柠檬酸水解后，其中的部分原生苷逐步转化为次级皂苷Rg₅。

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  图1 高效液相色谱法图谱

  Figure 1.Chromatogram of high performance liquid chromatography

  注：A. 人参皂苷Rg5标准品色谱图；B. 人参茎叶总皂苷色谱图；C.  提取试样色谱图。

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2.2 方法学考察结果

标准曲线评价：通过线性回归计算，对照品人参皂苷Rg₅的线性回归方程为Y=4 197.7x-11.416，相关系数R²=0.999 7。结果可见，对照品人参皂苷Rg₅在0.05~0.5 mg/mL范围内，浓度与峰面积线性关系良好。

精密度评价：本试验对人参皂苷Rg₅对照品标准溶液连续进样6次，峰面积的RSD值为0.27%，小于3%，表明本测定方法仪器精密度良好。

重复性评价：试验结果可知定量样品中人参皂苷Rg₅峰面积的RSD值为0.72%，结果稳定，说明本测定方法重复性良好。

稳定性评价：试验结果表明供试样品中人参皂苷Rg₅的峰面积RSD值为0.18%，说明供试品溶液在至少24 h内稳定。

准确度评价：根据方法条件，本试验测定的人参皂苷Rg₅加样回收率平均值为101.65%，其RSD%值为1.56%，表明此方法加样回收率较好。各项考察结果表明本方法操作简单、灵敏度高、重复性好、准确度高。

2.3 正交试验结果

2.3.1 正交优化试验结果

如表2所示，所选取的4个因素对人参皂苷Rg₅得率均有一定影响，人参皂苷Rg₅得率影响因素的主次顺序如下：反应温度（℃） ＞反应时间（h） ＞柠檬酸浓度（%）＞料液比（g ∶ mL），即D＞C＞B ＞A；最优方案为A3B²C3D3，即料液比（1  g  ∶  25  mL）、柠檬酸浓度30%、反应时间3 h、反应温度95 ℃。

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  表格2 L9（34）正交试验设计及结果

  Table 2.Design and results of the L9 (34) orthogonal test

  注：K值用于判断试验因素对试验指标的影响，K1为各因素1水平所对应的试验指标之和，k1为K1的平均值，若因素A对试验指标无影响，KA1、KA2、KA3应相等；同理，K2、K3分别对应各试验因素2、3水平的指标之和，k2、k3分别为K2、K3的平均值。

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2.3.2 正交试验方差分析结果

正交试验方差分析结果见表3，其中F值代表组间均方与组内均方的比值，它通过比较不同来源的变异来评估多组数据的均值情况，F值越大，说明处理之间的效果（差异）越明显，误差项越小，说明试验精度较高。由表3可知，4个因素处理间效果差异最大的是反应温度，说明反应温度对人参皂苷Rg₅得率的影响最大。本试验结果表明，柠檬酸浓度、反应时间、反应温度对提取率影响较大，料液比对得率的影响较小。

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  表格3 正交试验方差分析结果

  Table 3.Results of ANOVA of the orthogonal test

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2.3.3 验证试验

为了验证正交试验法优选条件的可行性，在优选条件下（为便于实际生产操作试验设置温度高点为95 ℃），将验证试验按料液比（1 g ∶ 25 mL）、柠檬酸浓度30%、反应时间3  h、反应温度95 ℃设置。在此优化条件下进行3次重复试验，结果得到人参皂苷Rg₅平均得率为9.42%，RSD为1.25%。验证试验表明优选条件提取工艺重复性和精密度较好，应用正交试验对柠檬酸水解制备人参皂苷Rg₅的工艺进行筛选，得到提取人参皂苷Rg₅含量较高的制备工艺，且该工艺稳定性高。

2.4 响应面法试验结果

2.4.1 响应面法试验设计及结果

将料液比、柠檬酸浓度、反应时间、反应温度4个因素按照表2的编码依据Box-Behnken设计模型进行29组试验，对4个因素进行条件优化，以人参皂苷Rg₅得率为响应面，确定最优提取条件，响应面法的试验结果见表4。

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  表格4 响应面法试验设计及结果

  Table 4.Design and results of the response surface experiments

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2.4.2 模型的建立

对响应面法试验结果数据进行处理，得到回归方程Y=8.89-0.004 2A-0.146 7B+0.510 0C+0.654 2D+0.027 5AB+0.04AC+0.075AD -0.012 5BC+0.015BD-0.187 5CD-0.343 7A²-0.379 9B²-0.219 9C²+0.026 3D2。由表5可知，该次模拟出的回归方程模型中F值为16.67，R²= 0. 943 4，P ＜0. 01，说明响应值94.34%的变化均能被该模型预测，变异系数（CV）为2.48%，表明用响应面法分析柠檬酸水解制备人参皂苷Rg₅工艺条件并建立模型与预测具有可行性。

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  表格5 响应面试验方差分析结果

  Table 5.Results of ANOVA of the response surface experiments

  注：决定系数R2=0. 943 4；调整系数R2Adj=0.886 8。

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模拟出的二次回归方程中料液比（A）、柠檬酸浓度（B）、反应时间（C）的二次项系数值均小于零，说明该模型中这三个因素存在稳定的顶点，即在此条件下存在人参皂苷Rg₅得率的最大值；而二次回归方程中反应温度（D）的二次项系数值大于零，说明其无最大值，但是为了便于实际生产，反应温度最高值设为95 ℃，即95 ℃为该因素响应值的顶点。

同时该模型中失拟项F值为3.67，P=0.111，表明失拟误差不显著，说明试验误差相对较小。该响应面试验的处理数据表明响应面法分析得到回归方程的拟合程度好，回归效果显著，试验结果具有很高的可信性和准确性，因此响应值与自变量间的多元回归关系适用于本模型。

由表5中F值和P值可知，一次项中仅因素料液比（A）的差异不显著，柠檬酸浓度（B）的差异性显著（P＜0.05），反应时间（C）和反应温度（D）的差异性均较显著（P＜0.01）。通过4个交互项的偏回归系数可以看出，4个交互项均不显著（P＞0.05），表明料液比（A）、柠檬酸浓度（B）、反应时间（C）、反应温度（D）4个影响因素的交互项对人参皂苷Rg₅得率影响均不显著（P＞0.05），4种影响因素的相互作用无意义。由F值可知，反应温度（D）＞反应时间（C）＞柠檬酸浓度（B） ＞料液比（A）为各个自变量对人参皂苷Rg₅得率的影响顺序。

2.4.3 响应面法对制备工艺的分析与优化

根据柠檬酸水解人参茎叶总皂苷制备人参皂苷Rg₅的工艺优化，在4个影响因素中，取其中2个因素作X轴和Y轴，以得率作Z轴，采用Design Expert 13软件创建两因素交互作用人参皂苷Rg₅得率影响的二维等高线图与三维曲面图。等高线图与三维曲面图可以直观地反映交互作用对人参皂苷Rg₅得率的影响程度。等高线的形状表明变量之间的交互影响显著性，圆形等高线表示两变量之间的交互影响不显著；椭圆形等高线表明两变量之间的交互影响显著。响应面曲面的坡度可反映该因素对人参皂苷Rg₅得率影响的强弱程度[19-20]。具体来说，曲面越陡，等高线越密集，则影响越显著。

如图2所示，在同一料液比条件下，当柠檬酸浓度为25%~30%，随着反应浓度的增加，人参皂苷Rg₅得率明显升高；之后随着柠檬酸浓度增加，人参皂苷Rg₅得率下降。顺着柠檬酸浓度的方向等高线密度变化相较料液比方向变化更大，说明柠檬酸浓度对人参皂苷Rg₅得率的影响大于料液比。

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  图2 料液比和柠檬酸浓度及其相互作用对人参皂苷 Rg5得率的响应面分析及等高线图

  Figure 2.Response surface analysis and contour map of solid-liquid ratio, citric acid concentration and their interaction on the yield of ginsenoside Rg5

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如图3所示，在同一料液比条件下，在反应时间2.0~3.0 h内，随着反应时间的增加，人参皂苷Rg₅得率逐渐升高，并且在反应时间方向人参皂苷Rg₅得率变化幅度较大，说明反应时间对人参皂苷Rg₅得率的影响大于料液比。

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  图3 料液比和反应时间及其相互作用对人参皂苷 Rg5得率的响应面分析及等高线图

  Figure 3.Response surface analysis and contour map of solid-liquid ratio, reaction time and their interaction on the yield of ginsenoside Rg5

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如图4所示，在同一料液比条件下，在反应温度85~95 ℃范围内，随着反应温度的增加，人参皂苷Rg₅得率逐渐升高，且在反应温度方向人参皂苷Rg₅得率变化幅度较大，对比两因素对得率的影响，反应温度大于料液比，根据颜色变化也可以看出，反应温度对人参皂苷Rg₅得率的影响较大。

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  图4 料液比和反应温度及其相互作用对人参皂苷 Rg5得率的响应面分析及等高线图

  Figure 4.Response surface analysis and contour map of solid-liquid ratio, reaction temperature and their interaction on the yield of ginsenoside Rg5

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综上所述，利用响应面图形分析、回归模型等分析料液比、柠檬酸浓度、反应时间、反应温度4 个因素对人参皂苷Rg₅得率的影响。4个因素对得率的影响顺序为反应温度＞反应时间＞柠檬酸浓度＞料液比。经响应面设计分析，最佳提取条件为料液比1 ∶ 20.70、柠檬酸浓度29.10%、反应时间2.88  h、反应温度95 ℃，得率最高可达9.71%。

2.4.4 验证试验

通过Design Expert 13软件求解回归方程，得到人参皂苷Rg₅得率优化制备条件，同时考虑到实际生产过程中条件控制精度问题，将优化条件修正参数为料液比1 ∶ 21、柠檬酸浓度30%、反应时间3 h、反应温度95 ℃。在此条件下进行3 次重复试验，平均得率为9.64%，RSD为1.42%，表明提取试验的重复性和精密度较好，模型预测的最大得率为9.71%，比验证试验的平均得率（9.64%）高0.07%，表明建立的模型和实际情况基本吻合，说明模型拟合性和有效性较好。

3 讨论

本研究通过正交试验和Box-Behnken响应面法对柠檬酸水解制备人参皂苷Rg₅的工艺进行优化。通过Design-Expert 13软件同时结合实际生产验证试验，表明建立的模型和实际情况基本吻合，模型拟合性和有效性较好。研究结果表明，反应温度和反应时间对人参皂苷Rg₅提取效果影响较大，需要在今后的实际应用中有效控制反应温度和时间。本研究仅进行了人参皂苷Rg₅的转化提取，但并未进行纯化制备的中试，经正交试验和Box-Behnken响应面法优化工艺的稳定性较高，适用于柠檬酸水解制备人参皂苷Rg₅提取工艺的优化，人参皂苷Rg₅得率较高。

本研究通过酸性环境对人参皂苷进行结构修饰，制备稀有人参皂苷Rg₅，相较于催化人参须根粉转化制备稀有人参皂苷，利用人参茎叶皂苷可以大大降低生产成本[21]，制备效果更佳，更适用于工业化生产制备。稀有人参皂苷天然含量稀少、生物利用度较高，其获得途径通常为从人参属植物中直接提取的原型皂苷经生物学或化学方法转化。近年来，出现了利用乳酸菌等发酵转化的途径，与本研究所采用的柠檬酸转化法相比，其所需的转化温度低，对环境要求更低，发酵所需时间较长，一般在24~72 h以上[22-23]。未来的研究有待进一步结合各转化方式的优势，综合提高转化效率，以达到生产试验等制备工艺适应所需的要求，同时为稀有人参皂苷的制备及大批量生产提供研究基础。

综上所述，本研究表明，正交试验和Box-Behnken响应面法适用于柠檬酸水解制备人参皂苷Rg₅提取工艺的优化，该方法操作简单，绿色环保，人参皂苷Rg₅得率较高，为未来开发人参皂苷结构修饰的研究和应用提供了重要参考。

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