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目的 通过网络药理学、分子对接模拟和体外细胞实验探讨四季青治疗支气管哮喘的作用机制。
方法 通过TCMSP数据库检索筛选得到四季青的活性成分和相关靶点，通过OMIM、GeneCards数据库进行检索，得到抗炎相关靶点，筛选出交集靶点，绘制韦恩图。利用Cytoscape 3.8.2软件进行网络拓扑结构分析，绘制“中药-活性成分-靶点-疾病”网络图，将共有基因靶点上传至STRING数据库，建立药物靶蛋白与疾病靶蛋白的蛋白质-蛋白质相互作用（protein-protein interaction，PPI）网络图，通过分子对接技术获得核心靶点和相关化合物结合能；建立RAW264.7细胞炎症模型，通过MTS法检测四季青对RAW264.7细胞活性的影响，采用Griess试剂法研究对NO信号通路的作用，采用ELISA法检测四季青对细胞上清液中炎症因子白介素-6（interleukin-6，IL-6）、肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）的影响。
结果 网络药理学结果显示，四季青的核心成分为谷甾醇、槲皮素、堪非醇、豆甾醇、醋酸坡模酸等，核心靶点有IL4、STAT、TNF、IL6、INFG等。基因本体论（Gene Ontology，GO）和京都基因与基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）富集分析得到主要的信号通路包括MAPK、NF-κB等。分子对接结果显示，四季青核心成分堪非醇、槲皮素与靶点分子对接亲和力均小于-4 kcal/J。细胞实验结果显示四季青能够显著降低炎性细胞中NO、IL-6、TNF-α的表达。
结论 四季青可以通过IL-6、TNF-α为代表的核心靶点及NO等关键通路改善炎性细胞的炎症反应。
支气管哮喘（简称哮喘）是由多种细胞参与，表现为反复性胸闷、气喘、咳嗽等症状的一种慢性炎症性疾病。气道炎症在哮喘发病机制中扮演着重要角色，哮喘炎症有许多细胞参与其中，包括T淋巴细胞、嗜酸性粒细胞、中性粒细胞、上皮细胞、肥大细胞等[1-2]。其发病机制与免疫调节的失衡、炎性介质的释放有关，因此，抑制炎症的产生对支气管哮喘具有一定的防治作用[3-4]。
四季青为冬青科植物冬青（Ilex chinensis Sims）的干燥叶，具有清热解毒、凉血止血等功效，临床上常应用于肺热咳嗽、咽喉肿痛、热淋、泻痢和水火烫伤等证候治疗[5-6]。现代植物化学研究结果表明，四季青的化学成分以酚酸类化合物和三萜类化合物为主，包含黄酮类、甾体、鞣质和胡萝卜苷等，同时，现代药理研究也显示四季青具有抗菌、抗炎等作用[7-8]。目前有关四季青抗炎作用的研究较为有限，四季青干预支气管哮喘的作用机制尚未明确。本研究基于网络药理学和分子对接探究四季青有效成分与各生物靶点之间的相互作用，并进行体外实验验证，以期为四季青的开发利用提供依据。
1 资料与方法
1.1 材料
1.1.1 细胞
RAW264.7细胞（小鼠单核巨噬细胞白血病细胞，ATCC细胞库，中国医学科学院药物研究所赠送）。
1.1.2 药品与试剂
四季青购自江西国都中药饮片公司，由乌鲁木齐市第一人民医院煎药室制备；脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）（美国Sigma公司，批号0000153963）；胎牛血清（美国Gibco公司，批号2409126CP）；1640培养基（美国Gibco公司，批号2851825）；亚硝酸盐还原试验试剂（Griess试剂）（美国Promega公司，批号0000231725）；MTS（美国Promega公司，批号0000240768）；小鼠TNF-α ELISA试剂盒（美国eBioscience公司，批号WP0380408255）；IL-6 ELISA试剂盒（美国eBioscience公司，批号PA04ZZPH8715）；二甲基亚砜（DMSO）（赛维尔生物公司，批号GP2409013）。
1.1.3 仪器
DSY2000X倒置荧光显微镜（重庆澳浦光电技术有限公司）；BPN-CH型CO2培养箱（上海一恒科学仪器有限公司）；RT-6100型酶标仪（深圳雷杜生命科学仪器有限公司）；多管架自动平衡离心机TDZ5-WS型（上海卢湘仪离心机仪器有限公司）；微量移液器（Gilson）。
1.2 网络药理学
1.2.1 四季青化学成分筛选及相关靶点预测
以口服生物利用度（oral bioavailability，OB）≥30%、类药性（drug-likeness，DL）≥0.18为条件，基于TCMSP数据库（https://www.91tcmsp.com/）筛选获得中药四季青的活性成分和相关靶点。在Uniprot数据库（https://www.uniprot.org/）进一步分析处理，剔除非人源基因、无效靶点和重复靶点，最后筛选出标准化的基因名称[9-10]。
1.2.2 支气管哮喘的相关联靶点获取
以“anti inflammation”为关键词，分别在GeneCards（https://www.genecards.org/）、OMIM （https://www.omim.org/）数据库中进行检索，筛选出与支气管哮喘有关的抗炎相关靶点，在 Microsoft Excel 2019软件中进行整合，去除重复基因，通过Uniprot数据库进行校正，得到抗炎相关靶点基因信息。在GeneCards、OMIM数据库中分别输入关键词“bronchial asthma”进行检索，得到抗支气管哮喘相关靶点，在Microsoft Excel 2019 软件中进行整合，剔除重复基因，最后通过Uniprot数据库进行数据规范化，得到抗支气管哮喘相关靶点基因信息。取二者共有靶点，得到抗炎抗支气管哮喘相关靶点基因信息。
1.2.3 筛选交集靶点
将获得的中药药物靶点和疾病靶点汇总，筛选交集靶点，利用在线平台（https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/）绘制韦恩图。
1.2.4 “药物-靶点-疾病”蛋白互作网络构建
物种设置为“Homo sapiens”，构建药物靶蛋白与疾病靶蛋白的蛋白质-蛋白质相互作用（protein-protein interaction，PPI）网络，将共有基因靶点上传至STRING数据库（https://cn.string-db.org/），将最低相互作用评分设定为0.4，其余参数均维持默认状态，将数据保存为TSV文件格式，导入Cytoscape 3.8.2软件进行可视化。使用CytoHubba插件评估调控网络的拓扑结构，筛选出四季青治疗支气管哮喘的核心靶点。
1.2.5 通路分析与富集分析
将四季青与支气管哮喘交集基因上传至DAVID数据库（https://davidbioinformatics.nih.gov/），OFFICIAL_GENE_SYMBOL为基因标识符，Homo Sapiens为物种设置，进行京都基因与基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）和基因本体论（Gene Ontology，GO）功能通路富集分析，GO功能从生物过程（biological process，BP）、细胞成分（cell components，CC）、分子功能（molecular function，MF）三方面阐述四季青在治疗支气管哮喘信号通路中的作用，预测四季青治疗支气管哮喘主要基因功能富集过程和信号通路及作用机制。
1.2.6 分子对接验证
利用分子对接技术评估四季青活性成分及其对应靶点之间的结合效能。基于PPI网络中MCC算法得出的重要性排名情况，选择四季青核心成分作用于支气管哮喘的靶点进行分子对接。从Pubchem数据库（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）获取化合物的三维结构sdf格式文件。将关键靶点作为受体，从RCSB数据库（https://www.rcsb.org/）下载受体对应的pdb格式文件，在Autodock Tools 1.2.7软件中进行对接，统计记录对接分数。
1.3 四季青水提取物的制备
称取四季青干燥叶300 g，用纱布包好，放入煎锅中加入6 000 mL蒸馏水，浸泡30 min后开始煎煮，先用武火煮沸，后调至文火煎煮60 min，倒入干燥器皿中，残渣再加入3 000 mL蒸馏水，再次煎煮60 min后倒出，合并两次药液，继续浓缩至150 mL，得到四季青水煎液，其生药浓度为2 000 mg/mL。
1.4 细胞实验
1.4.1 细胞处理分组及加药
将细胞随机分组为空白对照组、正常对照组、LPS模型组、样品组。除空白对照组外，其余三组取对数生长期的RAW 264.7细胞悬液于37 ºC、5% CO2，10%胎牛血清1640培养基中培养，以180 μL（3×104个/孔）接种于96孔培养板内，空白对照组取180 μL培养基于96孔板内，孵育18~24 h。四季青水提取物采用DMSO进行初步溶解，溶解后初始浓度为100 mg/mL。空白对照组、正常对照组每孔加培养基20 μL；LPS模型组每孔加10 μL LPS和10 μL培养基；样品组每孔加10 μL四季青水提取物，再加入10 μL LPS，使每孔体积为200 μL，药物的给药剂量分为2 μg/mL、10 μg/mL、50 μg/mL，药物与细胞充分作用24 h后取细胞上清液进行相关指标检测[11-12]。
1.4.2 细胞活性检测
将细胞与药物共同孵育24 h后，采用MTS法检测细胞活力。每实验孔加入MTS混合液10 μL，放入培养箱中继续培养4 h，待显色后将细胞板置于酶标仪490 nm波长处检测各孔的吸光值（optical density，OD）。
细胞存活率=（样品组OD490 nm-空白孔培养板OD490 nm）/（正常对照组OD490 nm-空白孔培养板OD490 nm）×100%。
1.4.3 细胞上清液中NO测定
细胞与药物共同孵育24 h后，采用Griess试剂检测NO值，根据说明书制作标曲；取一个新的细胞培养板，将各实验组分别取100 μL细胞上清液置于细胞板中，联合使用磺胺溶液与N-萘乙二胺盐酸各50 μL，静置15 min后，检测各样品组在540 nm波长处的OD[10]。
1.4.4 细胞上清液中炎症因子TNF-α、IL-6检测
采用TNF-α试剂盒检测细胞上清液中的炎症因子TNF-α，将细胞与四季青作用24 h后，每实验孔吸取20 μL细胞上清液后将上清液稀释150 倍，按TNF-α试剂盒说明书进行操作，于450 nm波长处检测各实验孔的OD。采用IL-6试剂盒检测细胞上清液中的炎症因子IL-6，将细胞与四季青相互作用24 h后，每孔吸取50 μL细胞上清液后将上清液稀释10倍，按IL-6试剂盒说明书进行实验，置于酶标仪450 nm波长处检测各孔的OD。
1.5 统计分析
细胞上清液的相关细胞因子水平均采用SPSS 28.0软件进行分析，计量资料采用均数和标准差（
）表示，组间两两比较采用t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 四季青治疗支气管哮喘作用靶点预测
本研究通过TCMSP数据库检索，得到四季青中槲皮素、堪非醇、β-谷甾醇、豆甾醇、醋酸坡模酸等成分。将各成分的靶点整合，去重后共有190个靶点。以relevance＞5为标准筛选，将Genecards数据库中得到的靶点与OMIM数据库获得的靶点整合在一起后去除重复值，共获得抗炎相关靶点1 904个，抗支气管哮喘靶点671个，二者重复靶点498个作为疾病靶点。将上述“药物-疾病”靶点相互映射，显示出73个中药四季青可能作用于疾病的靶点（图1）。进一步将上述靶点利用Cytoscape软件进行可视化，创建“药物-成分-靶点”关系的网络图（图2）。
2.2 共同靶点PPI网络构建
将韦恩图取得的交集靶标导入STRING数据库，获得PPI网络，共计73个蛋白节点和1 143条边（图3-A）。节点之间的连线即为边，表示两者存在相互作用。不同颜色对应不同的相互作用类型。进一步导入Cytoscape 3.8.2软件进行可视化（图3-B），直径越大、颜色越深代表该蛋白在这些蛋白的互作网络中越关键。利用cyto-hubba插件，按照degree值筛选排名前10的靶点作为核心靶点，见图3-C。
2.3 GO和KEGG富集分析
为探讨四季青在支气管哮喘治疗中的潜在分子机制，在DAVID数据库分析了疾病中的生物学过程和分子功能中涉及的重叠靶点。共检索出539个GO，包括423个BP、36个CC和80个MF。根据P值选择每个类别的前10个项目进行可视化（图4-A）。对KEGG通路富集的136个信号通路进行了分析，选取20个相关信号通路进行可视化（图4-B）。
2.4 分子对接结果
将上述筛选出的主要活性成分堪非醇、槲皮素与其靶点进行分子对接，对接亲和力越低，成分与靶点发生的可能性越大，见表1。2个分子分别与靶点结合均较好，化合物与靶点的结合能均处于-4.30 kcal/J 以下，其最低值为-5.84 kcal/J，由此推断这些蛋白质具有化合物潜在结合靶点的潜力。对结合能结果进行可视化，见图5。
2.5 四季青对细胞活力和细胞分泌NO浓度的影响
RAW264.7细胞经过四季青水提取物作用24 h后，未出现细胞毒性。经1 μg/mL LPS刺激后，巨噬细胞RAW264.7能够释放出大量的NO，与正常对照组相比有显著差异（P＜0.01），实验结果表明，四季青水提取物可以不同程度地抑制LPS诱导的RAW264.7细胞NO的释放，当四季青浓度梯度为50 μg/mL、10 μg/mL、2 μg/mL时，对细胞无毒性（图6），且对LPS刺激RAW264.7细胞释放的NO具有显著的抑制作用（P ＜0.01），见图7。
2.6 四季青水提取物对LPS诱导RAW 264.7细胞炎性因子TNF-α、IL-6释放的影响
与正常细胞比较，LPS可以明显促进RAW264.7细胞炎症因子TNF-α和IL-6的分泌（P＜0.01）。不同浓度四季青水提取物（2 μg/ mL、10 μg/mL、50 μg/mL）能够抑制LPS诱导的RAW264.7细胞释放炎症因子TNF-α和IL-6，并且具有显著的浓度依赖性，见图8、图9。
3 讨论
支气管哮喘是一种常见的慢性呼吸道疾病，其核心病理机制为气道慢性炎症，炎症与多种免疫细胞、炎症介质和细胞因子相互作用，这是机体一个重要的自身防御过程，但是如果长期或者过度存在，将会造成自身免疫性疾病，是慢性疾病发病机制中的一个重要危险因素[13-15]。四季青作为一种观赏性植物，同时具有抗菌、抗炎的特性，《中国药典（2020版）》明确记载四季青可用于治疗肺热咳嗽、咽喉肿痛、皮肤溃疡等，体现了其药用活性[5, 16-17]。
本研究通过网络药理学和分子对接技术初步预测了四季青与支气管哮喘之间的密切联系。网络药理学分析发现，四季青的核心成分包括槲皮素、堪非醇、β-谷甾醇、豆甾醇、醋酸坡模酸等。有研究表明，槲皮素、β-谷甾醇具有改善气道炎症的作用[18]。四季青治疗支气管哮喘的核心靶点包括IL-2、CHUK、TNF-α、IL-6、IL-4、IFNG等。研究发现，TNF-α、IL-6、IL-4、IFNG参与了哮喘的气道炎症，能够抑制炎性因子的释放，对支气管哮喘具有防治作用[19-21]。
PPI网络分析结果表明，四季青的有效成分主要作用于IFNG、TNF、MMP-9、TGF-β1、CASP3、BCL2、TP53、PTGS2、CCL2、PPARG多个核心靶点，其中TNF、MMP-9可能是四季青治疗支气管哮喘的关键靶点。有研究表明，激活TNF/MMP-9信号通路会使TNF-α、IL-6等炎症因子的表达上调，引起气道炎症和气道高反应性，从而导致支气管哮喘病情加重[22]。槲皮素可以抑制氧化应激反应对肺组织的损伤，从而减轻炎症反应。
KEGG通路分析结果表明，P53、TNF信号通路可能是四季青治疗支气管哮喘的靶点，在调节细胞周期方面，P53信号通路具有核心作用，其中关键基因TP53可干扰抗凋亡因子与铜的结合，从而使促凋亡蛋白从线粒体中释放，导致肺组织细胞凋亡。P53可以通过激活TNF-α和TNF相关的凋亡诱导配体的转录和信号传导来促进细胞凋亡[23]。有研究发现，槲皮素可以通过调节P53信号通路，抑制肺细胞的凋亡，从而延缓支气管哮喘的发病[24]。
体外细胞实验发现，四季青对NO及炎症因子TNF-α、IL-6具有一定的抑制作用。有研究表明，促炎细胞因子TNF-α、IL-6，以及效应分子NO在炎症性疾病的发展过程中起着重要作用，TNF-α、IL-6参与了先天性免疫和自身免疫性疾病，而高浓度的NO可以导致氧化损伤和自身性免疫疾病[25-26]。另有研究显示，相对于正常受试者而言，支气管哮喘患者呼出的NO浓度相对较高，NO水平的升高和氧化应激的增强可能导致强过氧亚硝酸根的形成，从而导致支气管气道中的蛋白质亚硝基化，最终导致气道炎症[26-27]。因此，抑制NO的产生和炎症因子的释放对炎症性疾病具有一定的治疗作用。抑制巨噬细胞过量分泌NO可以起到预防炎症性疾病的作用[27]。本研究通过用LPS刺激巨噬细胞RAW264.7建立细胞炎症模型，四季青作用于炎症细胞模型后可以抑制由LPS刺激RAW264.7细胞释放的NO，并且具有剂量依赖性，说明四季青水提取物具有抑制炎性介质NO生成的作用，对炎性疾病具有一定的治疗效果。TNF-α是TNF家族中最重要的促炎因子，与自身免疫性疾病、感染、肿瘤等疾病相关，主要由巨噬细胞、T细胞等免疫细胞产生，在免疫应答、炎症等生理和病理过程中发挥着关键作用[28-29]。IL-6在炎症性疾病、感染性疾病、免疫性疾病等中发挥着重要作用，是促炎反应的核心介质[30-31]。本研究结果表明，四季青提物对TNF-α和IL-6炎症因子的分泌具有一定的抑制作用，并且具有剂量依赖性，通过抑制炎症介质的释放来改善炎症反应。
综上所述，本研究通过网络药理学及体外细胞实验对四季青提取物抗支气管哮喘作用机制进行了初步探究，发现四季青可以抑制炎症因子的释放，为后续研究四季青对支气管哮喘和其他肺部疾病防治机制提供了理论基础。本研究仍存在一定局限性，主要通过公开数据库进行分析，而药物与炎性细胞的作用机制需进一步通过临床试验加以验证。
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