目的  采用网络药理学、分子对接技术结合细胞实验验证的方式，探讨异甘草素治疗口腔黏膜下纤维化的作用机制。

方法  在TCMSP、Comparative Toxicogenomics Database和PharmMapper数据库中搜寻异甘草素的相关作用靶点；通过GeneCards、DisGeNet、OMIM数据库查找口腔黏膜下纤维化的疾病靶点。借助Venny网站在线筛选二者的共同靶点，利用STRING数据库对这些靶点开展蛋白质-蛋白质相互作用（protein-protein interaction，PPI）网络分析。将共同靶点输入DAVID数据库，进行基因本体论（Gene Ontology，GO）和京都基因与基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）生物信息学分析。使用AutoDock Vina 1.2.x软件对异甘草素与核心靶点进行分子对接验证。在体外培养人永生化角质形成细胞（HaCaT 细胞系）后，运用CCK-8法研究不同浓度异甘草素对HaCaT细胞存活率的影响，根据CCK-8结果选取20 μM、40 μM、80 μM的异甘草素浓度用于后续实验。将细胞分为空白组、模型组、异甘草素低剂量组、异甘草素中剂量组、异甘草素高剂量组，采用实时荧光定量聚合酶链式反应（quantitative real-time polymerase chain reaction，qRT-PCR）法检测各组细胞中MMP9、EGFR、TGFB1、TNF、MAPK3的mRNA表达水平。

结果  共筛选出异甘草素潜在作用靶点391个、口腔黏膜下纤维化相关靶点969个、二者交集靶点65个；异甘草素作用靶点活性成分度（degree）值排名靠前的为IL6、MMP9、TGFB1、TNF、AKT1等；GO分析显示，生物学过程（biological process，BP）主要涉及胰岛素样生长因子受体信号通路、细胞对活性氧的反应、凋亡过程负调控、细胞对镉离子的反应、细胞外基质分解等，细胞组分（cellular component，CC）主要涉及细胞质、受体复合体、细胞外基质、线粒体、局灶性粘连等，分子功能（molecular function，MF）主要涉及同种蛋白结合、酶结合、内肽酶活性、蛋白质同源二聚化活性、蛋白激酶活性等；KEGG分析结果表明，异甘草素治疗口腔黏膜下纤维化与癌症的途径、FoxO信号通路、HIF-1信号通路、MAPK信号通路、AGE-RAGE信号通路等相关。分子对接结果显示，异甘草素对MMP9、EGFR、TGFB1、TNF、MAPK3等靶点具有较强的结合能力。体外细胞实验结果表明，与空白组相比，模型组MMP9、EGFR、TGFB1、TNF、MAPK3的mRNA水平均显著升高（P＜0.01）；与模型组相比，异甘草素低、中、高剂量组MMP9、EGFR、TGFB1、TNF、MAPK3的mRNA水平均显著降低（P ＜0.01）。

结论  异甘草素治疗口腔黏膜下纤维化的分子机制可能与抑制 MMP9、EGFR、TGFB1、TNF、MAPK3等细胞因子的表达相关，涉及细胞增殖分化进程、细胞外基质合成与沉积、上皮-间充质转化过程、炎症反应的启动、细胞内信号传导等过程。

口腔黏膜下纤维化（oral submucous fibrosis，OSF）是一种具有癌变倾向的慢性进行性口腔疾病，严重影响患者的口腔功能和生活质量[1]。目前，OSF的发病机制尚未完全明确，且缺乏有效的根治方法。其临床治疗手段有限，以减轻症状、延缓疾病进展为主[2]。因此，深入研究OSF的发病机制，寻找安全有效的治疗药物具有重要意义。异甘草素（isoliquiritigenin，ISL）是甘草中的一种重要活性成分，具有抗炎、抗氧化、抗肿瘤、调节免疫等多种药理活性[3-5]。近年来，ISL在多种疾病治疗中展现出潜在应用价值，其对组织纤维化相关疾病的干预作用逐渐受到关注。研究表明，ISL能够通过调节细胞因子的表达、抑制炎症反应和纤维化相关信号通路，对肝纤维化、肺纤维化等疾病起到一定的抑制作用[6-7]。ISL能够显著抑制肝星状细胞的活化，通过调控TGF-β1/Smad信号通路减少细胞外基质（extracellular matrix，ECM）成分（如Ⅰ型胶原蛋白）的合成与沉积，从而有效减缓肝纤维化进程[8]。在肺纤维化方面，ISL通过抑制肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白介素-6（interleukin-6，IL-6）等炎症因子的释放，减轻肺部炎症反应，进而发挥对肺纤维化的治疗作用。鉴于ISL在其他组织纤维化疾病中的治疗潜力，同时组织纤维化疾病在发病机制上存在一定共性，如炎症反应和纤维组织异常增生等，推测ISL可能对OSF也具有治疗效果。但目前关于异甘草素在OSF治疗中的相关研究相对缺乏，具体作用机制尚不明确。

网络药理学能够从系统生物学的角度，整合药物成分、作用靶点和疾病相关信息，构建药物-靶点-疾病网络，从而全面、系统地揭示药物治疗疾病的潜在机制[9]。分子对接技术可以在计算机水平上模拟药物小分子与靶蛋白的相互作用，从原子层面阐述药物作用的分子机制，为药物研发提供有力的理论依据[10]。细胞实验能够在体外对药物的作用进行直接验证，进一步明确药物对细胞生物学行为的影响。本研究采用上述方法，对ISL治疗OSF的作用机制展开深入研究，以期为OSF的临床治疗提供新的策略和理论支持。

1 资料与方法

1.1 网络药理学及分子对接分析

1.1.1 异甘草素靶点筛选

在TCMSP数据库（https://www.tcmsp-e.com/load_intro.php?id=43）中输入“isoliquiritigenin”进行靶点查找。通过TCMSP数据库获取ISL的mol2格式文件，随后将该文件导入PharmMapper数据库（http://www.lilab-ecust.cn/pharmmapper/）。在PharmMapper数据库操作时，选择物种为人类（Homo sapiens），以筛选对应的基因靶点。在Comparative Toxicogenomics Database数据库（https://ctdbase.org/）中，以“isoliquiritigenin”作为检索关键词，获取与ISL相关的基因靶点。完成上述操作后，对从这3个不同数据库中筛选得到的所有ISL相关基因靶点进行去重处理，得到准确且无重复的ISL作用靶点集合。

1.1.2 口腔黏膜下纤维化疾病靶点筛选

以“Oral Submucous Fibrosis”作为检索关键词，在GeneCards数据库（https://www.genecards.org/）、DisGeNet数据库（https://disgenet.com/）以及OMIM数据库（https://www.omim.org/）中搜索OSF相关疾病靶点，对重复靶点予以剔除。

1.1.3 异甘草素靶点与口腔黏膜下纤维化疾病相关靶点交集

使用Venny在线工具（https://www.bioinformatics.com.cn/static/others/jvenn/example.html），导入从网络数据库获取的ISL靶点和OSF相关靶点，筛选出二者交集靶点并绘制韦恩图。

1.1.4 构建异甘草素-口腔黏膜下纤维化疾病靶点的蛋白质-蛋白质相互作用网络

将上述交集靶点信息上传至STRING 12.0数据库（https://cn.string-db.org/），构建蛋白质-蛋白质相互作用（protein-protein interaction，PPI）网络，将物种设定为“Homo sapiens”。完成网络构建后，导出相应的PPI网络图，并把相关结果以TSV格式文件的形式下载保存。

1.1.5 构建异甘草素-口腔黏膜下纤维化疾病靶点的核心网络图

将PPI网络图的TSV格式文件导入Cytoscape 3.9.1软件，运用该软件的CytoHubba插件对关键核心靶点进行解析，并通过degree拓扑算法分析ISL与OSF的共同靶点。基于分析结果，绘制ISL-OSF疾病靶点的核心网络拓扑结构图谱，依据分析数据筛选出排名前10的关键靶点。

1.1.6 基因本体论和京都基因与基因组百科全书通路富集分析

将ISL与OSF的交集靶点输入DAVID数据库（https://david.ncifcrf.gov/）开展生物信息学分析，明确ISL治疗OSF过程中的生物过程（biological process，BP）、分子功能（molecular function，MF）、细胞组成（cellular component，CC）及相关作用通路。以校正P＜0.05为标准筛选结果，按P值升序排序，分别选取基因本体论（Gene Ontology，GO）、京都基因与基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）分析前20位结果，使用微生信平台（https://www.bioinformatics.com.cn/）对富集分析结果进行可视化处理。

1.1.7 分子对接

从PDB数据库（https://www.rcsb.org/）获取10个潜在共同靶标蛋白的三维结构，修饰并添加氢键，作为受体文件。同时，从PubChem数据库（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）下载ISL的二维结构，经过能量最小化处理后，将其作为配体文件。随后把受体文件和配体文件导入AutoDock Vina 1.2.x软件进行10次对接操作，计算每次对接的结合能，并选取最低结合能所对应的构象来报告对接结果。

1.2 实验细胞株和主要试剂

人永生化角质形成细胞HaCaT购自武汉普诺赛生命科技有限公司，批号CL-0090。CCK-8试剂盒由北京全式金生物提供，货号C0038。Trizol试剂生产厂家为上海碧云天生物，货号R0016。Advanced qPCR SYBR Master Mix来自翌圣生物科技（上海）股份有限公司，货号11185ES08。实时荧光定量聚合酶链式反应（quantitative real-time polymerase chain reaction，qRT-PCR）所需引物由上海生工生物工程公司设计合成。

1.3 药品

ISL购自MedChemExpress公司，批号HY-N0145，其含量≥98.92%。

1.4 仪器

多功能酶标仪（瑞士Tecan公司，型号：Infinite M200 Pro）；高速冷冻离心机（上海天美公司，型号：Centrifuge5810R）；倒置显微镜（德国Carl·Zeiss公司，型号：Vert.A1）；荧光定量PCR仪（宁波SCIENTZ 新芝公司，型号：Real-Time PCR System SQ510）。

1.5 实验验证

1.5.1 细胞培养

将HaCaT细胞置于含DMEM完全培养液的培养体系中，在37 ℃、5%CO2培养箱内培养。当细胞生长至融合度达80%~90%时，采用0.25%胰蛋白酶进行消化处理，随后按1 ∶ 3的比例进行细胞传代操作。

1.5.2 不同浓度异甘草素对细胞存活率的影响

选取处于对数生长期的细胞，以6×10³/孔的密度接种于96孔板。设置0 μM、10 μM、20  μM、40 μM、80 μM、100 μM 共6个ISL实验组[11-12]，每组设3个复孔。待细胞贴壁后，按分组加入含不同浓度ISL的细胞完全培养液。继续培养24 h、48 h和72 h后弃去原培养液，加入CCK-8工作液，置于细胞培养箱反应2 h。随后使用酶标仪在450 nm波长下测定各孔吸光度（optical density，OD）值，计算细胞存活率以选定实验药物浓度。

1.5.3 实验分组干预

依据CCK-8测得的细胞存活率，选定20  μM、40 μM、80 μM ISL为后续实验给药浓度。实验分五组：空白组，模型组，ISL低、中、高剂量组。空白组用不含ISL的完全培养液培养24 h；模型组用含50 μg·mL^-1槟榔碱（areca nut extract，ANE）的完全培养液培养24 h；ISL低、中、高剂量组分别用含20 μM、40 μM、80 μM ISL的完全培养液干预24 h。

1.5.4 qRT-PCR实验检测各组细胞中引物的mRNA表达水平

本实验用Trizol法提取细胞总RNA，提取后用分光光度计测得总RNA浓度。在逆转录酶作用下，用寡聚dT引物合成cDNA，用SYBR PCR master Mix进行qRT-PCR扩增。SYBR Green结合双链DNA监测扩增。扩增前先95 ℃预变性3 min，40个循环（95 ℃ 15 s、60 ℃ 30 s、72 ℃ 20 s），最后95 ℃ 15 s、60 ℃ 15 s结束。以GAPDH为内参基因，用2-ΔΔCt 法计算得出目的基因相对表达量，引物序列见表1。

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  表格1 实时荧光定量聚合酶链式反应基因引物信息

  Table 1.Gene primer information of quantitative real-time polymerase chain reaction

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1.5.5 统计分析

采用SPSS 26.0软件分析数据，符合正态分布的计量资料以均数和标准差（）表示，并进行方差齐性检验。方差齐时，采用单因素方差分析比较组间差异，LSD法作两两比较；方差不齐则用Dunnett's T3检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 网络药理学及分子对接结果

2.1.1 异甘草素与口腔黏膜下纤维化靶点交集分析

从TCMSP、PharmMapper、CTD数据库分别获取33、294、106 个靶点，去重后得到391个相关基因靶点。分别在GeneCards、DisGeNet、OMIM数据库中检索得到894、19、79个OSF疾病靶点，合并去重得到969个相关靶点。将391个ISL作用靶点与969个OSF疾病靶点输入Venn图网站，得到药物与疾病共同靶基因65个，见图1。

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  图1 异甘草素与口腔黏膜下纤维化交集靶点的Venn图

  Figure 1.Venn diagram of the intersection target of isoliquiritigenin and oral submucous fibrosis

  注：ISL，isoliquiritigenin，异甘草素；OSF，oral submucous fibrosis，口腔黏膜下纤维化。

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2.1.2 异甘草素-口腔黏膜下纤维化疾病靶点的蛋白质-蛋白质相互作用网络

将65个ISL与OSF的交集靶点导入STRING 12.0数据库获得PPI网络，共65个节点，693条边，平均节点degree值为21.3，见图2。

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  图2 异甘草素与口腔黏膜下纤维化交集靶点的蛋白质-蛋白质相互作用网络

  Figure 2.Protein-protein interaction network of the intersection target of isoliquiritigenin and oral submucous fibrosis

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2.1.3 异甘草素-口腔黏膜下纤维化疾病靶点的核心网络图

将交集靶点导入Cytoscape软件，利用CytoHubba插件开展关键核心靶点拓扑分析，绘制ISL-OSF疾病靶点核心网络拓扑结构图，筛选出前10位关键靶点，即MMP9、EGFR、TGFB1、TNF、MAPK3、PTGS2、ALB、IL6、AKT1、BCL2，见图3。

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  图3 异甘草素与口腔黏膜下纤维化交集靶点核心网络图

  Figure 3.Core network diagram of the intersection target of isoliquiritigenin and oral submucous fibrosis

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2.1.4 基因本体论和京都基因与基因组百科全书富集分析结果

将ISL和OSF的交集靶点导入DAVID数据库，得到ISL治疗OSF的生物信息分析结果。选取GO、KEGG分析前20位结果绘制气泡图，图中气泡大小与富集基因数呈正相关关系，颜色深浅与P值呈负相关关系。结果表明，ISL治疗OSF的靶点主要富集在胰岛素样生长因子受体信号通路、细胞对活性氧的反应、凋亡过程负调控、细胞对镉离子的反应、细胞外基质分解等BP，见图4-A；ISL治疗OSF的靶点主要富集在细胞质、受体复合体、ECM、线粒体、局灶性粘连等CC中，见图4-B；ISL治疗OSF的靶点主要富集在同种蛋白结合、酶结合、内肽酶活性、蛋白质同源二聚化活性、蛋白激酶活性等MF中，见图4-C。KEGG分析结果显示，ISL治疗OSF与癌症的途径、FoxO信号通路、HIF-1信号通路、MAPK信号通路、AGE-RAGE信号通路等有关，见图4-D。

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  图4 异甘草素与口腔黏膜下纤维化交集靶点的基因本体论、京都基因与基因组百科全书富集分析结果气泡图

  Figure 4.Bubble map of Gene Ontology and Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes enrichment analysis results of the intersection target of isoliquiritigenin and oral submucous fibrosis

  注：A. 基因本体论富集生物过程分析气泡图；B. 基因本体论富集细胞组成分析气泡图；C. 基因本体论富集分子功能分析气泡图；D. 京都基因与基因组百科全书富集分析气泡图。

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2.1.5 分子对接结果

选取核心基因靶点前10位靶蛋白与ISL进行分子对接，共得到10组结果，见表2。分子对接结果显示，ISL与核心靶点的结合能均≤-7.0 kJ/mol，具有较高的结合活性，并从一定程度上验证了预测结果的准确性。图5为用Pymol软件进行可视化的ISL与上述核心靶点对接的最终结果，小分子ISL位于大分子蛋白质的口袋中，形成多个氢键。

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  表格2 异甘草素与核心靶点的结合能

  Table 2.Binding energy of isoliquiritigenin to core targets

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  图5 异甘草素与核心靶点的分子对接可视化结果

  Figure 5.Visualization results of molecular docking between isoliquiritigenin and core targets

  注：A. 异甘草素与MMP9；B. 异甘草素与EGFR；C. 异甘草素与TGFB1；D. 异甘草素与TNF；E. 异甘草素与MAPK3；F. 异甘草素与PTGS2；G.  异甘草素与ALB；H. 异甘草素与IL6；I. 异甘草素与AKT1；J. 异甘草素与BCL2。

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2.2 实验验证结果

2.2.1 不同浓度异甘草素对细胞存活率的影响

CCK-8实验表明，培养24 h时，与0 μM ISL相比，10 μM、20 μM、40 μM、80 μM浓度对细胞活力无显著影响（P＞0.05），浓度升至100 μM时，细胞活力显著下降（P＜0.01）；随着培养时间延长至48 h、72 h时，与0 μM ISL相比，细胞活力均显著下降（P＜0.01），见图6。而20 μM、40 μM、80 μM ISL组细胞活力仍保持相对稳定（均＞75%），表明该浓度下ISL在较长时间内对细胞活力无明显不良影响，因此本研究选择20 μM、40 μM、80 μM设置为ISL低、中、高剂量组浓度，培养24 h。倒置显微镜下HaCaT细胞形态显示，各组细胞生长状态好，为多角形铺路石样连接紧密，成团生长，呈典型上皮细胞样。

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  图6 不同浓度异甘草素对细胞活力的影响（x ± s，n=3）

  Figure 6.Effects of different concentrations of isoliquiritigenin on cell viability (x ± s, n=3)

  注：与0 μM药物浓度组比较，**P＜0.01。

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2.2.2 qRT-PCR实验检测结果

qRT- PCR法检测核心基因靶点前10位靶蛋白与ISL进行分子对接结果中结合能最小的5个靶蛋白的mRNA相对含量。与空白组相比，模型组 MMP9、EGFR、TGFB1、TNF、MAPK3的mRNA水平均显著升高（P＜0.01）；与模型组相比，ISL低、中、高剂量组MMP9、EGFR、TGFB1、TNF、MAPK3的mRNA 水平均显著降低（P＜0.01），提示ISL可能通过下调MMP9、EGFR、TGFB1、TNF、MAPK3治疗OSF，见图7。

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  图7 qRT-PCR检测各组细胞MMP9、EGFR、TGFB1、TNF和MAPK3的mRNA表达水平（，n=3）

  Figure 7.The mRNA expression levels of MMP9, EGFR, TGFB1, TNF and MAPK3 in each group of cells detected by qRT-PCR (, n=3)

  注：a. MMP9 mRNA表达水平；b. EGFR mRNA表达水平；c. TGFB1 mRNA表达水平；d. TNF mRNA表达水平；e. MAPK3 mRNA表达水平。A. 空白组；B. 模型组；C. 异甘草素低剂量组；D. 异甘草素中剂量组；E. 异甘草素高剂量组。与空白组相比，##P＜0.01；与模型组相比，**P ＜0.01。

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3 讨论

OSF作为一种口腔疾病，不仅严重影响患者的口腔功能和生活质量，还具有潜在的恶变风险。目前，OSF的发病机制尚未完全明确，其临床治疗手段也较为有限。本研究综合运用网络药理学、分子对接和细胞实验，对ISL治疗OSF的作用机制进行了多维度的探讨，以期为OSF的治疗提供了新的思路和理论依据。

本研究通过多个数据库筛选，确定了391个ISL潜在作用靶点和969个OSF相关靶点，进而得到65个交集靶点。在这些交集靶点构建的PPI网络中，MMP9、EGFR、TGFB1、TNF、MAPK3等关键靶点呈现出较高的节点度值、中介中心性及紧密中心性参数特征。MMP9在ECM的降解过程中发挥着关键作用，在OSF的发展过程中，MMP9的异常高表达会导致ECM成分（如胶原蛋白）的过度降解，破坏ECM的正常结构和功能，进而引发口腔黏膜下层纤维组织的异常增生和胶原的过度沉积[13]。ISL可能通过作用于MMP9靶点，调节ECM的代谢平衡，抑制纤维化进程[14-15]。EGFR作为细胞表面的重要受体，参与细胞的增殖、分化和存活等多个关键过程[16]。在OSF患者体内，EGFR的异常激活与上皮细胞和成纤维细胞的异常增殖密切相关[17]。ISL靶向EGFR可能调节细胞的增殖和分化信号通路，纠正细胞的异常行为，从而改善OSF的病理状态[18]。TNF作为一种重要的炎症细胞因子，在炎症反应的发生发展中起着关键作用。在OSF的病理过程中，TNF的过度表达会引发炎症细胞的大量浸润，导致炎症级联反应，进一步加重组织损伤和纤维化程度[19]。ISL对TNF靶点的调控可能通过抑制炎症反应的强度[20]，减轻口腔黏膜的炎症状态，为缓解纤维化创造有利条件。TGFB1是参与纤维化过程的关键细胞因子之一，它能够促进成纤维细胞的活化和增殖，刺激ECM成分的合成和分泌，导致胶原的过度沉积[21]。ISL作用于TGFB1靶点，可以抑制TGFB1介导的纤维化信号通路，减少ECM的合成[7]，从而缓解OSF的纤维化进程。MAPK3则参与细胞内多种信号传导通路，与细胞的增殖、分化、凋亡和炎症反应密切相关。在OSF中，MAPK3信号通路的异常激活可能导致细胞的异常增殖和炎症反应的加剧[22]。异甘草素通过调节MAPK3靶点，从而调节相关信号传导，抑制细胞的异常增殖和炎症反应，对OSF的治疗发挥积极作用。

本研究对关键靶点之间的相互作用关系进行深入探讨。以MMP9和TGFB1为例，通过分析发现，它们之间存在直接的蛋白质-蛋白质相互作用。在OSF的病理过程中，TGFB1过度表达促进ECM合成，MMP9异常高表达导致ECM过度降解，进而引发口腔黏膜下层纤维组织的异常增生和胶原的过度沉积[23]。ISL可能通过同时调节MMP9和TGFB1的表达，重新平衡ECM的合成与降解，抑制纤维化进程。同时，通过进一步探讨关键靶点在信号通路中的协同作用，发现TNF和MAPK3在OSF的炎症反应和细胞增殖过程中发挥重要作用。TNF能够激活MAPK3信号通路，当TNF与细胞表面受体结合后，通过一系列信号传导过程，激活MAPK3，进而激活下游的NF-κB信号通路，促进炎症细胞因子的表达和细胞增殖相关基因的转录[24]。而ISL可能通过同时调节TNF和MAPK3，抑制NF-κB信号通路的过度激活，减少炎症细胞因子的释放，抑制细胞的异常增殖，从而对OSF起到治疗作用。

GO分析结果显示，ISL治疗OSF的靶点主要富集在胰岛素样生长因子受体信号通路、细胞对活性氧的反应、凋亡过程负调控、细胞外基质分解等BP中。胰岛素样生长因子受体信号通路的异常与细胞的增殖、分化和代谢紊乱密切相关[25]，在OSF的发展过程中，该通路的异常激活可能促进上皮细胞和成纤维细胞的异常增殖[26]，从而引发一系列炎症反应和氧化应激反应，促进纤维化的发展。ISL可能通过抑制AGE-RAGE信号通路的激活，减轻炎症反应和氧化应激，抑制纤维化进程[27]。细胞对活性氧的反应与氧化应激密切相关，OSF患者口腔黏膜组织中氧化应激水平升高，会导致细胞损伤和纤维化的发生[28]。ISL可能通过调节细胞对活性氧的反应，减轻氧化应激对细胞的损伤[29]，从而缓解OSF的病情。凋亡过程负调控在OSF中表现为细胞凋亡减少，导致纤维组织过度积累[30]。ISL影响凋亡过程负调控，可能促进细胞凋亡[31]，减少纤维组织的积累，改善口腔黏膜的纤维化状态。ECM分解过程的异常与OSF中纤维组织的增生密切相关，ISL对该过程的调节有助于维持ECM的正常代谢平衡，抑制纤维化的发展[32]。

KEGG通路富集分析表明，ISL治疗OSF与癌症的途径、FoxO信号通路、HIF-1信号通路、MAPK信号通路和AGE-RAGE信号通路等相关。其中，HIF-1信号通路在OSF的缺氧微环境中起着重要作用[33]。在缺氧条件下，HIF-1α会稳定表达并与HIF-1β结合形成有活性的HIF-1，进而激活一系列下游基因的表达。这些基因参与血管生成、细胞增殖和ECM代谢等过程，促进纤维化的发展[34]。ISL可能通过抑制HIF-1α的表达或活性，干扰HIF-1与靶基因的结合，从而抑制相关下游基因的表达，减少血管生成异常和ECM的过度沉积[35]，缓解OSF的病情进展。FoxO信号通路在细胞的增殖、凋亡和应激反应中发挥着重要的调节作用[36]。在OSF中，FoxO信号通路的异常可能导致细胞增殖和凋亡失衡，促进纤维化的发生。ISL作用于该通路，可能调节细胞的增殖和凋亡过程[37]，恢复细胞的正常生理平衡，对OSF的治疗产生积极影响。AGE-RAGE信号通路与氧化应激、炎症和纤维化密切相关[38]。在OSF患者体内，晚期糖基化终末产物（AGEs）的积累会激活RAGE受体，引发一系列炎症反应和氧化应激反应，促进纤维化的发展[39]。与以往研究单一靶点或通路不同，本研究构建了异甘草素-靶点-疾病网络，从整体层面剖析其治疗OSF的潜在机制，为中药活性成分治疗OSF提供了新的研究思路和方法。

分子对接结果显示，ISL与MMP9、EGFR、TGFB1、TNF、MAPK3等核心靶点具有较强的结合能力，结合能均≤-7.0 kJ/mol。这从原子层面验证了ISL与这些靶点相互作用的可能性，为ISL的作用机制提供了更直接的证据，支持了网络药理学的预测结果。以ISL与MMP9的结合为例，分子对接显示ISL与MMP9的TYR-197、LYS-137、GLY-125等氨基酸残基形成长度为2.6 Å、2.0 Å、2.5 Å的氢键。通过这些氢键参数可以看出，ISL与MMP9 的结合较为稳定，从结构生物学角度为ISL对MMP9的作用提供了有力支持。同时，文献研究表示ISL与靶点结合后可能影响其构象变化并调节下游信号通路[40]。以ISL与 EGFR结合为例，有研究表明，ISL与EGFR结合后可能导致EGFR受体的二聚化状态发生改变，干扰EGFR 的二聚化过程，抑制其下游

 Ras/Raf/MEK/ERK信号通路的激活，即EGFR二聚化受阻后，Ras蛋白的激活受到抑制，进而影响Raf激酶的磷酸化，导致MEK和ERK的磷酸化水平降低，阻断细胞增殖信号的传导，最终发挥对纤维化疾病的治疗作用[41]。体外细胞实验进一步验证了ISL的治疗作用。qRT-PCR实验结果显示，与空白组相比，模型组MMP9、EGFR、TGFB1、TNF、MAPK3的mRNA水平显著升高，这与OSF的病理过程中炎症反应增强、ECM代谢紊乱等特征相符；而与模型组相比，ISL低、中、高剂量组中这些基因的mRNA水平显著降低，说明ISL能够通过下调MMP9、EGFR、TGFB1、TNF、MAPK3的表达，抑制炎症反应、调节ECM合成与沉积、抑制上皮-间充质转化过程等，从而发挥对OSF的治疗作用。

综上所述，本研究整合网络药理学、分子对接技术和细胞实验，系统探讨了ISL治疗OSF的潜在机制，为理解OSF的发病与治疗机制提供了新视角，为开发OSF的创新疗法和药物靶点奠定了理论基础。本研究也存在一定的局限性，仅进行细胞实验验证了ISL对相关细胞因子表达的影响，聚焦于部分关键靶点和通路。后续研究可综合多组学技术和动物实验，从病理学、药理学等多学科交叉视角深入剖析，明确其体内作用机制，进一步为OSF的精准防治提供策略。

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