目的  探讨亚低温治疗对心肺复苏后大鼠膈肌功能的影响及潜在机制。

方法  将46只雄性Wistar大鼠随机分为对照组（Sham）、正常体温组（NT）、正常体温复苏组（NTR）、亚低温组（MT）、亚低温复苏组（MTR），Sham组6只、其余实验组每组各10只。NTR组和MTR组大鼠心肺复苏后体温分别维持在37±0.5℃和（33±0.5℃）机械通气12小时，NT组和MT组大鼠行假手术后体温分别维持在37±0.5℃和（33±0.5℃）持续机械通气12小时，Sham组大鼠行假手术后体温维持在37℃自主呼吸12小时。实验结束后检测膈肌收缩力、纤维横截面积（cross-sectional area，CSA）、 丙二醛（malonicdialdehyde，MDA）、肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）和白细胞介素-6 （interleukin 6，IL-6）水平，并评估膈肌形态结构变化。

结果  与Sham组相比，各实验组膈肌收缩力和纤维横截面积显著降低（P＜0.05）；与MT组相比，NT组、NTR组和MTR组膈肌收缩力和纤维横截面积也显著降低（P＜0.05），膈肌MDA、TNF-α和IL-6水平则均显著升高；与NTR组相比，MTR组膈肌收缩力和肌纤维横截面积显著升高（P＜0.05），膈肌MDA、TNF-α和IL-6水平则均显著降低（P＜0.05）。

结论  亚低温可以显著改善心肺复苏后的膈肌收缩力下降和纤维萎缩，可能与其抑制炎症反应、减轻氧化应激损伤有关。

心搏骤停仍是引起临床突发性死亡的首要原因。心肺复苏是公认的抢救心搏骤停病人最有效的方式，但复苏后的缺血再灌注性损伤继发多器官功能障碍，仍是导致病人死亡的首要因素[1]。膈肌是人体最主要的呼吸肌，缺血再灌注性损伤同样会影响膈肌的功能[2]。通常心肺复苏成功的病人往往需要以机械通气为基础的高级生命支持，但长时间的机械通气较容易导致膈肌发生功能障碍[3]。临床上发生功能障碍的膈肌表现为收缩力的下降和膈肌纤维的萎缩，从而引起呼吸机撤机困难，增加病人的死亡风险[4]。

目前认为，过度的氧化应激和炎症反应是危重病人膈肌功能障碍的主要发生机制，减轻氧化应激和炎症刺激是改善膈肌功能障碍的主要手段[5]。亚低温治疗是减轻复苏后机体氧化应激损伤和炎症反应的重要手段之一[6]，通过将全身或局部体温控制在30~35℃，可以显著改善心、脑、肝等重要脏器的缺血再灌注性损伤[7]，但其对心肺复苏后膈肌功能的影响仍不明确。本研究旨在探讨亚低温治疗对心肺复苏后膈肌收缩力、纤维横截面积（cross-sectional area，CSA），以及炎症反应和氧化应激指标的影响。

1 资料与方法

1.1 实验试剂与仪器

8周龄SPF级雄性Wistar大鼠由武汉万千佳兴实验动物公司提供。动物饲养于武汉大学动物实验中心，维持温度在25℃、湿度约50%，并保持12小时昼夜交替和自由进食水。TNF-α（ab236712）、IL-6（ab234570）和MDA（ab118970）检测试剂盒和一抗（MY-32，ab51263；NQD7.5.4D，ab11083；laminin，ab11575）均购自Abcam（上海）公司，二抗（Alexa Fluor 546标记的驴抗小鼠，A10036；Alexa Fluor 488标记的驴抗兔，A-21206）购自赛默飞（上海）公司，台氏液购自武汉普诺赛公司。体外肌肉收缩力检测系统购自奥尔科特（上海）公司，小动物呼吸机购自Harvard（美国）公司，体温维持仪购自软隆（北京）公司，生命体征监测仪器购自泰盟（成都）公司，荧光显微镜（Olympus，日本）由武汉大学中南医院科研中心提供。

1.2 实验动物与分组

将46只雄性Wistar大鼠随机分为对照组（Sham）、正常体温组（NT组）、正常体温复苏组（NTR组）、亚低温组（MT组）、亚低温复苏组（MTR组），其中Sham组6只、其余实验组每组各10只。Sham组：大鼠行假手术后体温维持在正常水平（37±0.5℃）并自主呼吸12小时；NT组：大鼠行假手术后体温维持在正常水平（37±0.5℃）并持续机械通气12小时。NTR组：大鼠心肺复苏后体温分别维持在正常水平（37±0.5℃）并持续机械通气12小时。MT组：大鼠行假手术后体温维持在亚低温水平（33±0.5℃）并持续机械通气12小时；MTR组：大鼠心肺复苏后体温维持在亚低温水平（33±0.5℃）并持续机械通气12小时。该实验经武汉大学动物实验中心实验动物管理与使用委员会批准（2021034）。

1.2 心肺复苏模型构建

大鼠心肺复苏模型构建方法参照文献[8]。戊巴比妥钠（60 mg·kg^-1）腹腔注射麻醉后，将大鼠置于保温毯上。体温监测探头通过肛门进入体内约4 cm深度用于监测体温。经颈气管切开后置入14F气管导管，使大鼠保持自由呼吸，并经右侧颈外静脉和左侧颈动脉分别置入24F和22F导管。将葡萄糖生理盐水（1 mL·kg^-1·h-1）和戊巴比妥钠（10 mL·kg^-1·h-1）通过右侧颈外静脉导管持续泵入。左侧颈动脉导管连接生命体征监测仪，动态监测大鼠动脉血压和血气。气管导管连接小动物呼吸机，夹闭窒息法构建心搏骤停，以平均动脉压小于20 mmHg且无动脉波形判定为心跳停止。心跳停止后立即开始胸前按压和机械通气，胸前按压频率为200次/分，按压呼吸比为2 ∶ 1。每30秒为一次心肺复苏组，并持续直至恢复自主循环。3个心肺复苏循环后，仍未恢复自主循环判定为心肺复苏失败。恢复自主循环定义为：平均动脉压在60 mmHg以上并维持至少5分钟。在恢复自主循环后的1小时和2小时分别吸入纯氧和50%氧浓度的空气混合气体，之后吸入空气。机械通气参数设置为频率60~70次/分，潮气量6 mL·kg^-1，吸呼比1 ∶ 1，呼气末正压2 cmH₂O。整个过程中不使用血管活性药物。心肺复苏成功后将大鼠置于冰袋上进行降温，MT组和MTR组大鼠体温维持在（33℃±1℃）。NT、NTR和Sham组大鼠在整个实验过程中体温均维持在正常水平（37℃）。按照各组设计进行12小时的机械通气或自主呼吸。每4小时监测一次动脉血气，根据血气结果调整呼吸机通气参数，维持机械通气大鼠动脉血氧分压在80~100 mmHg，二氧化碳分压小于50 mmHg。实验结束后，采用过量戊巴比妥钠（150 mg·kg^-1）注射的方法处死大鼠，采集相关组织标本进行检测。

1.3 检测指标

1.3.1 基础生命体征

包括大鼠的体温、心率、平均动脉压（MAP），动脉血气指标包括pH、氧分压PaO₂、二氧化碳分压PaCO₂、碳酸氢根HCO₃^-、血乳酸水平，以及血常规指标（淋巴细胞比例和中性粒细胞比例）。

1.3.2 大鼠膈肌收缩力

参照既往研究的方法[9]，在体外进行膈肌收缩力测量。处死大鼠后，迅速剪取左侧肋弓下膈肌组织，修剪成约5 mm × 3 mm的肌条。金属固定夹固定肌条上下两端，垂直放于27℃，95% O₂和5% CO₂的混合气体持续氧合的台氏液中20分钟。之后在刺激电压10 V、波长2 ms、刺激间隔2分钟的条件下开始获取膈肌的最佳初长度，并在最佳初长度下获取最大强直收缩力、频率－收缩力曲线和疲劳指数。测量结束后，游标卡尺测量肌条在最佳初长度下的物理长度（cm）和湿重。按照肌肉的密度，分析每个肌条在最佳初长度下的横截面积（横截面积=湿重/密度/肌条长度）。

1.3.3 大鼠膈肌纤维横截面积与形态

新鲜的膈肌组织OCT包埋后液氮速冻，用冰冻切片机制备厚度约7 μm的薄片。切片经甲醇固定30秒后，PBS洗涤三次，每次1分钟。5%BSA室温下封闭30分钟，PBS冲洗掉多余的BSA，添加一抗（NQD7.5.4D），按1 ∶ 300比例覆盖组织，4℃孵育过夜。PBS洗涤三次，每次5分钟，添加二抗（Alexa Fluor 546），室温下孵育1小时。PBS洗涤三次，每次5分钟。抗荧光淬灭剂封片，荧光显微镜下观察、拍照。参照既往研究方法[9]，ImageJ软件计算分析每个纤维的横截面积，每片膈肌组织至少分析200条不同的肌纤维。4%多聚甲醛固定的膈肌标本，采用常规石蜡切片行HE染色，并在显微镜下观察拍照大鼠膈肌纤维形态。

1.3.4 大鼠膈肌氧化应激和炎症指标

新鲜的膈肌组织约30 mg，加入500 μL的RIPA裂解液冰上匀浆，4℃离心后获取上清液，根据MDA、TNF-α和IL-6相关检测试剂盒的使用说明书进行指标的定量分析。

1.4 统计分析

数据经Excel导入Prism软件中进行分析。采用Shapiro-Wilk方法检验数据的正态分布情况，正态分布数据以均数和标准差（x±s）描述，多组间样本均数的比较采用方差分析，以P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 基础生命体征

实验结束时，MTR组和MT组大鼠的体温、心率和血乳酸水平显著低于NT组和NTR组（P＜0.05），但四组大鼠之间的平均动脉压（MAP）、动脉血气指标（pH、PaO₂、PaCO₂、HCO3-）、血常规指标（中性粒细胞比例和淋巴细胞比例）均无显著差异。Sham组与NT组大鼠之间在上述指标方面的差异均无统计学意义（表1）。

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  表格1 各组大鼠在实验结束时的生命体征、动脉血气和血常规指标

  Table 1.Characteristics of vital signs, arterial blood gas and blood routine of rats in each group at the end of the experiment

  注：*与NT组比较，P＜0.05；#与MT组比较，P＜0.05；&与NTR组比较，P＜0.05

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2.2 大鼠膈肌收缩力

与Sham组相比，各实验组大鼠的膈肌收缩力指标均明显下降（P＜0.05）。其中，NT、MTR和NTR组大鼠膈肌最大紧张收缩力、最大强直收缩力、40Hz至120Hz刺激频率下的收缩力和疲劳指数均显著小于MT组（P＜0.05）。NTR组的上述指标显著小于MTR组，且均小于NT组（图1）。

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  图1 各组大鼠膈肌收缩功能参数

  Figure 1.Diaphragmatic contractile function parameters in each group of rats

  注：A.最大紧张收缩力统计图；B.最大强直收缩力统计图；C.收缩力－刺激频率曲线；D.疲劳指数统计图；*与相关组相比，P＜0.05

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2.3 大鼠膈肌纤维横截面积与形态

与Sham组相比，各实验组大鼠的Ⅰ型和Ⅱ型膈肌横截面积均显著减小（P＜0.05）。其中，NT、MTR和NTR组大鼠的Ⅰ型和Ⅱ型膈肌CSA均显著小于MT组（P＜0.05）。NTR组大鼠的I型和Ⅱ型膈肌CSA显著小于MTR组，且均小于NT组（图2）。HE染色观察下，五组大鼠膈肌纤维均轮廓完整，排列规则，间质未见水肿、出血和明显炎症细胞浸润现象。

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  图2 各组大鼠膈肌纤维横截面积、免疫荧光及HE染色形态学观察

  Figure 2.The cross-sectional area, immunofluorescence and HE staining morphology of dia-phragm fibers in each group of rats

  注：A.各组大鼠膈肌Ⅰ型和Ⅱ型纤维横截面积；B.各组大鼠膈肌纤维的免疫荧光（上图）和HE染色（下图，标尺均为50 μm）；免疫荧光图绿色代表纤维轮廓，红色代表I型纤维，黑色代表II型纤维，蓝色代表细胞核；HE图红色代表肌纤维，蓝色代表细胞核

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2.4 大鼠膈肌氧化应激和炎症指标

NT、MTR和NTR组大鼠膈肌的MDA、TNF-α和IL-6水平均显著高于MT组（P＜0.05）。NTR组大鼠的MDA、IL-6和TNF-α水平显著高于MTR组，且都显著高于MT组。各实验组的上述指标均显著高于Sham组（图3 ）。

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  图3 各组大鼠的膈肌MDA、TNF-α和IL-6水平

  Figure 3.The levels of MDA、TNF-α and IL-6 in diaphragm in each group of rats

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3 讨论

本研究发现，心肺复苏引起的缺血再灌注会显著降低膈肌的收缩力，减少膈肌纤维横截面积，引起显著的膈肌功能障碍。采用亚低温治疗可有效改善心肺复苏后的膈肌功能障碍，这可能与其降低氧化应激水平、抑制炎症反应损伤有关。

心肺复苏后的缺血再灌注损伤一直是临床上面临的巨大挑战。心搏骤停后，机体各器官的血供大幅减少，组织处于缺氧状态。当缺血细胞再灌注重新获得氧供的短时间内，中性粒细胞大量激活，耗氧量显著增加[10]，产生的活性氧和活性氮类物质增多，超过机体对其清除能力，则引起氧化应激[11-12]。临床上危重病人常伴有不同程度的膈肌功能障碍[13]，过度的氧化应激和炎症反应是引起膈肌功能障碍的主要机制[14]。多项动物研究指出，使用氧自由基清除剂能够有效减轻膈肌功能障碍的程度[15-17]。而亚低温是临床上行之有效的降低心肺复苏后氧化应激损伤的方法之一[18]，但目前亚低温对膈肌本身功能的影响仍未明确。国外有研究指出，31℃时可以保护人体膈肌的收缩功能[19]，但动物实验显示更进一步的低温（15℃）会导致膈肌收缩力下降[20]。本实验结果表明，亚低温（33±0.5℃）并不会影响膈肌本身的功能，还能够有效改善因机械通气引起的膈肌功能障碍。机械通气引起膈肌功能障碍的机制主要是线粒体功能障碍，活性氧或活性氮类物质生成增多，进而激活一系列蛋白降解通路，并抑制蛋白合成通路，从而导致膈肌发生萎缩、收缩力下降[21]。此外，氧自由基还可以通过损伤肌球蛋白直接引起收缩力下降。心肺复苏后往往需要以机械通气为基础的高级生命支持治疗，而长时间的机械通气易导致膈肌发生失用性萎缩。在心肺复苏后，膈肌面临着缺血再灌注和失用性萎缩两大危险因素，缺血再灌注后短时间内形成的氧化应激风暴可能加重膈肌功能障碍的程度，或加速其出现的时间。本研究结果显示MTR组的膈肌收缩力和纤维横截面积显著小于NT组，进一步说明了缺血再灌注对膈肌功能的负面影响。

此外，本研究还发现亚低温能够减轻心肺复苏后大鼠膈肌TNF-α和IL-6升高的幅度，说明亚低温对减轻炎症反应具有一定作用。全身炎症反应综合征是心肺复苏后机体出现的重要体征之一，且有研究指出全身的炎症反应与心搏骤停的时间有关[22]。在本实验中，大鼠心搏骤停后立刻开始心肺复苏，但这并不能够抑制膈肌炎症反应的出现。一些炎症因子，如IL-6的上调表达可通过STAT3/JAK通路引起下肢骨骼肌的萎缩[23]。亚低温可能是直接通过抑制炎症因子释放的方式来保护缺血再灌注后的膈肌功能。此外，炎症反应和氧化应激之间相互促进和相互制约的关系会影响膈肌功能。例如，IL-6可以通过刺激血管紧张素Ⅱ1型受体的方式诱导内皮细胞的氧化应激损伤[24]，但IL-6也可通过增强抗氧化和自噬的途径减轻胰腺β细胞的氧化应激[25]。目前，在膈肌功能障碍的发生机制中，炎症反应和氧化应激之间的相互关系仍没有完全阐释清楚。对于心肺复苏后的膈肌，氧化应激和炎症反往往同时存在，而亚低温能够有效减轻心肺复苏后膈肌的氧化应激和炎症反应损伤。

本研究仍存在以下局限。第一，膈肌收缩力体外检测时的温度（27℃）低于动物实际体温（33±0.5℃或37±0.5℃）。国内外研究一致认为，体外肌肉收缩力检测时，27℃能获得肌肉的最大收缩力。虽然肌条在台式液中平衡20 min，但温度短时间内的改变对肌肉真实收缩力的影响无法完全避免。第二，胸外按压时对膈肌可能造成的损伤不能确定。按压过程中可能存在按压幅度过深的情况，这种情况下，胸廓的回弹（尤其是末端肋骨）可能对膈肌造成牵拉性损伤。第三，建立的心肺复苏模型不能完全模拟临床。为避免血管活性药物对膈肌的影响，在大鼠心肺复苏过程中未使用此类药物，而在临床上，常常使用血管活性药物来增加心肺复苏的成功率。

基于本实验结果，将来在临床上可以通过超声或跨膈压力检测的方法，明确亚低温对心肺复苏后患者膈肌功能的影响，以期能够为临床有效预防膈肌功能障碍提供参考。

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