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目的 分析常用增塑剂替代品乙酰柠檬酸三丁酯（acetyl tributyl citrate，ATBC）对阿尔茨海默病（Alzheimer's disease，AD）发病机制的潜在影响，揭示ATBC对AD的毒性作用以及关键分子途径之间的复杂相互作用。
方法 通过ADMETlab 2.0和ProTox 3.0平台预测ATBC毒性特征，利用SwissTargetPrediction和ChEMBL数据库筛选ATBC作用靶点，通过GeneCards和OMIM数据库收集AD相关靶点。构建蛋白质-蛋白质相互作用网络，识别核心靶点，并进行基因本体论（Gene Ontology，GO）和京都基因与基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）功能富集分析，最后通过分子对接验证关键分子间的结合亲和力。
结果 毒性预测结果显示，ATBC具有血脑屏障损伤等神经毒性。筛选出124个ATBC与AD的交集靶点，其中STAT3、EGFR、MMP9、CTSB和MAPK1为核心靶点。功能富集分析结果显示，ATBC主要通过干扰炎症反应、GABA能神经传递、淀粉样蛋白代谢和蛋白激酶信号等关键生物过程影响AD发展。分子对接结果证实ATBC与五个核心靶点均具有较强的结合亲和力（结合能均小于-5.0 kcal/mol），其中与STAT3的结合最稳定（-7.1 kcal/mol）。
结论 ATBC可通过多种协同机制促进AD病理进程，主要表现为与STAT3、EGFR、MMP9、CTSB和MAPK1等核心靶点高亲和力结合，进而激活神经炎症反应、破坏GABA能突触传递、诱导脑内胰岛素抵抗与代谢紊乱，并加速β-淀粉样蛋白沉积与tau蛋白病理进程。这些发现为ATBC的神经毒性风险评估提供了重要的理论基础，同时为制定AD的环境防控策略及多靶点干预方案提供了参考。
阿尔茨海默病（Alzheimer's disease，AD）作为最常见的神经退行性疾病，已成为全球重大的公共卫生问题。近年来，我国AD及其他痴呆患者约1 699万人，占全球病例的近三分之一，患病率显著高于全球平均水平，且女性和高龄人群患病率更高［1］。1990—2021年，我国AD发病人数持续增长，疾病负担日益加重［2］。2020—2050年，AD及其他痴呆症对全球经济的累计影响预计高达1万亿美元以上［3］。AD的病理特征主要包括细胞外β-淀粉样蛋白（amyloid β-protein，Aβ）斑块沉积、细胞内tau蛋白过度磷酸化形成的神经原纤维缠结及神经炎症反应的激活，这些病理改变相互作用，最终导致神经元死亡和认知功能进行性下降［4］。影响AD发病的因素众多，环境因素正受到持续关注。研究表明，接触空气污染物及不良生活习惯等因素对AD发病具有重要影响［5］。
乙酰柠檬酸三丁酯（acetyl tributyl citrate，ATBC）是一种重要的非邻苯二甲酸酯类增塑剂，其作为传统邻苯二甲酸酯增塑剂的“更安全”替代品，于20世纪90年代在人们对邻苯二甲酸酯毒性日益关注的背景下被引入［6］。然而，ATBC的广泛应用导致其在环境中大量积累。有研究显示，ATBC已在多种环境介质中被检出，包括室内灰尘、食品包装材料等［7］。研究表明，ATBC及其代谢产物在尿液中检出率较高，儿童等易感人群的暴露风险尤为突出［8］。这种广泛而持续的ATBC暴露引发了对人群长期健康效应的担忧，尤其是对神经系统的潜在影响。研究发现，ATBC可通过食物链和环境暴露途径进入人体，并在体内蓄积［9］。毒理学研究对其进行验证，揭示了ATBC可能具有内分泌干扰作用和神经毒性［10-12］。动物实验表明，长期ATBC暴露可导致大鼠出现空间学习记忆能力下降、自主活动减少等神经行为学改变，并引起斑马鱼神经发育异常和运动行为障碍［13］。在细胞水平，ATBC可诱导神经母细胞瘤细胞和海马神经元产生氧化应激，继而引发线粒体功能障碍，最终导致细胞凋亡［14］。
传统毒理学研究方法存在耗时长、成本高且难以全面揭示化合物作用机制等局限性。网络毒理学作为新兴交叉学科，整合系统生物学、生物信息学和毒理学方法，能从系统层面预测化合物毒性机制，已成功应用于肝毒性、神经毒性预测等研究［15-17］。分子对接技术通过预测小分子与蛋白质靶点的结合模式和亲和力，可为毒性机制研究提供分子层面的理论基础［18］。目前，已有研究提示ATBC可能具有神经毒性，但其在AD发生发展中的具体分子靶点和通路网络尚未明确。因此，本研究采用网络毒理学与分子对接相结合的方法，系统分析ATBC对AD的潜在毒性作用，识别关键靶点和通路，阐明其分子机制，以期为评估ATBC安全性和制定AD预防策略提供参考。
1 资料与方法
1.1 ATBC网络毒理学分析
从PubChem数据库（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）获取ATBC的标准SMILES（simplified molecular-input line-entry system）结构，并将其输入ADMETlab 2.0（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）和 ProTox 3.0平台（https://tox.charite.de/protox3/）进行毒性评估，所有分析均使用智人参数。
1.2 ATBC相关靶点筛选
基于SwissTargetPrediction（https://swisstargetprediction.ch）和ChEMBL数据库（https://www.ebi.ac.uk/chembl/）获取ATBC相关靶点。将ATBC的SMILES结构输入SwissTargetPrediction数据库，采用默认参数。在ChEMBL数据库中检索ATBC化合物名称，提取已知的蛋白质靶点。将全部靶点基因名称通过UniProt数据库统一转换为标准官方基因符号，去除列表内部及合并后列表中的重复靶点，并严格限定物种为“homo sapiens”，仅保留经确认的人源靶点。
1.3 AD相关靶点筛选
利用GeneCards（https://www.genecards.org/）和OMIM数据库（https://omim.org/）获取AD相关疾病靶点。以“Alzheimer's disease”为关键词检索GeneCards数据库，获取AD相关靶点及其对应的“relevance score”。该评分整合了多种数据源信息，用于评估基因与目标疾病的相关程度。为确保靶点的可靠性并便于后续分析，仅选取“relevance score”大于或等于该检索结果所有基因评分中位数的基因作为候选疾病靶点。以“Alzheimer's disease”为关键词检索OMIM数据库，获取AD相关靶点。在数据处理阶段，首先对GeneCards数据库中获得的靶点进行中位数过滤，筛选出高置信度的靶点，然后将两个数据库的靶点合并，去除重复靶点，最后对合并后的靶点进行人工核对，确保所有基因名称符合标准命名规范，并限定为人类基因。
1.4 ATBC与AD交集靶点筛选
使用微生信平台（https://www.bioinformatics.com.cn/）对ATBC和AD相关靶点取交集，绘制韦恩图。
1.5 蛋白质-蛋白质相互作用网络构建
利用STRING数据库（http://string-db.org/）构建ATBC和AD交集靶点的蛋白质-蛋白质相互作用（protein-protein interaction，PPI）网络，限定物种为智人，将检索获得的互作关系文件以TSV格式下载保存，并将其导入Cytoscape 3.8.0软件，使用Network Analyzer插件评估网络的结构属性并识别关键节点，节点的大小和颜色根据它们的度值进行调整。MCODE插件用于识别相互作用节点的最显著模块，通过CytoHubba插件结合多种网络拓扑学算法（度值、中介中心性、接近中心性）计算各节点的评分，从而筛选出前10个关键靶点。
1.6 基因本体论与京都基因与基因组百科全书功能富集分析
为探究差异表达基因潜在的生物学功能，使用DAVID数据库（https://davidbioinformatics.nih.gov/）对ATBC与AD的交集靶点进行基因本体论（Gene Ontology，GO）和京都基因与基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）功能富集分析，筛选显著富集条目（校正P < 0.05）。最终结果通过微生信平台以气泡图或条形图进行可视化呈现。
1.7 分子对接验证
通过PubChem数据库（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）获取小分子配体的2D结构，经Chem Office转化为3D结构后保存为mol2文件。利用RCSB PDB数据库（http://www.rcsb.org/）筛选蛋白靶点且分辨率较高的分子对接受体。采用AutoDock Vina 1.5.6软件进行分子对接，以探索蛋白配体的相互作用。首先通过AutoDock软件对蛋白（加氢、去水）及配体（加氢、确定扭转键）进行处理，再设定对接盒子坐标进行构象搜索，通过比较对接结果的得分大小，最终得到分子模拟的最优构象。通过PyMOL 2.4.0和Discovery Studio 2019软件可视化分析配体-受体相互作用的2D和3D模式，用于直观展示配体与受体间的结合模式与稳定性，验证分子对接结果的合理性。通常，结合能小于-5.0 kcal/mol表明两者具有较好的结合活性，小于-7.0 kcal/mol表明有较强的结合活性，结合能越低则说明两者结合活性越强，亲和力越高，构象也越稳定。
2 结果
2.1 ATBC毒性预测结果
预测结果显示，ATBC可能损伤血脑屏障，见表1。血脑屏障损伤既是AD早期事件，又是推动Aβ和tau沉积、神经炎症的关键因素［19］。这表明ATBC可能通过对血脑屏障的毒性作用加速AD的病理过程。毒性报告还显示出ATBC具有致癌性、药物性肝损伤、眼部腐蚀及刺激作用。
2.2 ATBC和AD相关靶点预测结果
共获得184个ATBC相关靶点和7 625个AD疾病靶点，两者交集靶点共124个，见图1，这些交集靶点可能是ATBC影响AD病理发生发展的关键靶点。
2.3 蛋白质-蛋白质相互作用网络
基于STRING数据库对124个交集靶点构建PPI网络（图2），并将交集靶点导入Cytoscape软件进行可视化分析。如图3所示，STAT3的度值最高，在整个PPI网络中占据核心枢纽位置，表明其在ATBC调控AD病理机制中可能发挥关键作用。
2.4 核心靶点
根据度值、中介中心性及接近中心性三个关键参数进一步对交集靶点进行筛选，最终获得STAT3、EGFR、MMP9、CTSB及MAPK1等核心靶点，见图4、表2。为进一步探究核心靶点间的功能模块关系，采用MCODE插件进行模块分析，结果显示，这些核心靶点形成了多个密集的模块（图5），提示其在生物学功能上可能存在协同作用。红色聚类是网络中连接最密集、功能最核心的蛋白质群，表明其可能是ATBC影响AD病理机制中起决定性作用的蛋白质集合。
2.5 功能富集分析结果
GO富集分析结果显示，在生物过程（biological process，BP）层面，ATBC相关靶点主要富集于炎症反应、GABA能突触传递、Aβ形成和淀粉样前体蛋白分解过程；在细胞组分（cellular component，CC）层面，主要富集于神经投射、突触后膜、GABA-A受体复合体和γ-分泌酶复合体；在分子功能（molecular function，MF）层面，富集于蛋白激酶活性、肽酶活性和GABA门控通道活性等功能，见图6。这些结果表明ATBC的毒性作用主要影响突触结构和功能，特别是与AD核心病理机制相关的淀粉样蛋白代谢和神经炎症过程。
KEGG通路富集分析识别出20条显著富集通路，主要涉及代谢调节通路（胰岛素抗性、脂质与动脉粥样硬化）、炎症与细胞死亡通路（炎症介质调节TRP通道、HIF-1信号通路、细胞凋亡）、神经功能通路（GABA能突触、神经营养因子信号通路），以及疾病相关通路（AD、AGE-RAGE信号通路），见图7。
2.6 化合物-通路-核心靶点网络
基于KEGG富集分析结果，选取P值排名前5位的显著富集通路构建化合物-通路-核心靶点网络（图8）。结果显示，ATBC通过与STAT3、MMP2、PIK3CA、MAPK1等核心靶点相互作用，可能同时干扰大脑的抑制性神经传递系统（GABA能突触）、诱发胰岛素抵抗相关的代谢功能障碍、激活AGE-RAGE介导的神经炎症级联反应，并破坏内源性大麻素系统的神经保护功能。这种化合物-通路-靶点的协同作用揭示了ATBC通过多种协同机制共同促进AD病理进展的潜在机制。
2.7 分子对接结果
将筛选的核心靶点与ATBC进行分子对接，见图9。如表3所示，ATBC与各核心靶点的结合能均小于-5 kcal/mol，表明具有较强的结合亲和力。其中，ATBC与STAT3的结合亲和力最高（-7.1 kcal/mol），显示出最强的结合能力和最稳定的构象相互作用。三维结构分析和二维相互作用图谱显示，ATBC与各靶点主要通过范德华力、疏水相互作用和氢键等多种非共价相互作用形成稳定的蛋白-配体复合物。具体而言，对接分析识别出ATBC与各核心靶点间存在一系列关键氢键，包括STAT3（GLU652、TYR218），EGFR（ARG841、ASP855），MMP9（HIS230、TYR248），CTSB（SER467、ASP594）以及MAPK1（ASP106、GLN105）。这些氢键的键长均落在2.7～3.2 Å的典型范围内，加之广泛的疏水作用与范德华力，共同从原子层面构成了其高亲和力结合的结构基础。结果表明，ATBC可能通过同时调控多个关键靶标蛋白发挥生物学效应，进而影响AD病理进程。
3 讨论
本研究采用网络毒理学和分子对接方法系统探讨了ATBC诱导AD的潜在分子机制。ATBC作为一种广泛应用于工业生产和消费品制造的新兴环境污染物，主要通过呼吸道吸入、经皮肤接触和食物摄入等多种途径暴露于人群。研究表明，ATBC暴露可显著扰乱神经系统内稳态，引发一系列神经退行性病理改变，主要表现为认知功能缺陷、学习记忆障碍和持续性神经炎症反应［10］。随着对ATBC毒性危害认识的不断深入，国际监管机构已开始关注其健康风险，并积极推动相关替代技术和产品的研发应用［20-21］。然而，目前开发的替代产品可能具有相似的神经毒性，凸显了建立毒性评估体系的紧迫性［22-23］。本研究侧重于ATBC的单独效应，主要考虑以下两方面：一是现有毒理学研究证据已初步证实ATBC暴露会引起相关神经退行病理改变，二是ATBC在AD发病过程中的具体作用机制尚缺乏深入的分子水平阐释。本研究通过系统解析ATBC对AD的分子发病机制，以为后续开展替代化学品毒性筛查提供了重要参考。
通过ADMETlab 2.0和ProTox 3.0平台确定了ATBC对血脑屏障的神经毒性作用，同时获取了ATBC暴露对AD产生潜在影响的124个相关靶点，对这些靶点进行MCODE功能模块分析，提示ATBC可能通过多个模块对AD协同发挥毒性作用。红色模块中多种GABA受体与MAPK主要功能为神经传递、突触可塑性和神经元信号传导，提示ATBC可能通过干扰神经传递机制发挥毒性作用［24-27］；黄色模块中γ-分泌酶复合体（PSEN1/2、APH1A/B、NCSTN）、STAT3、TLR9、MMPs等的主要功能为淀粉样蛋白前体蛋白处理、免疫激活、细胞外基质重塑，代表了AD的核心病理机制［28-30］；绿色模块中ADORA1/2A的核心功能为神经保护［31］；蓝色模块中HDAC4的出现提示糖代谢与细胞能量平衡等代谢机制在ATBC对AD毒性作用中的重要性［32］。各模块间存在交互作用，形成了毒性级联反应。这提示ATBC可能通过同时影响AD的多个关键发病环节来发挥毒性作用。
PPI 网络分析结果显示，STAT3、ECFR、MMP9、CTSB、MAPK1可能是ATBC诱导AD的核心靶点。ATBC与STAT3的紧密结合可能干扰STAT3的转录调节功能。STAT3是JAK2/STAT3信号通路的核心转录因子，其参与AD的病理过程，影响小胶质细胞、星形胶质细胞和神经元功能［33-34］。在AD病理状态下，ATBC结合导致的STAT3功能异常可能促进星形胶质细胞过度激活和反应性增生，加剧神经炎症反应［35］。ATBC与EGFR的结合可能影响EGFR磷酸化和下游信号传导，在AD病理状态时，Aβ沉积激活EGFR，导致下游信号轴持续磷酸化，促进更多Aβ产生和tau蛋白的异常磷酸化，引发神经炎症和细胞因子（TNF-α、IL-1β等）释放［36-37］。ATBC与MMP9的相互作用可能增强MMP9的酶活性，进而促进tau寡聚体的形成，加速神经纤维缠结的病理进程［38］。AD患者脑脊液中MMP-9/TIMP-1比值的异常升高进一步证实了MMP9在神经变性早期过程中的关键作用［39］。组织蛋白酶B（CTSB）是溶酶体半胱氨酸蛋白酶，在AD患者血清和脑脊液中病理性上调，且与认知功能下降密切相关［40］。ATBC与CTSB结合可能进一步破坏CTSB的正常功能，促进其从溶酶体向细胞质的异常重新分布，同时增强其作为替代β-分泌酶参与Aβ产生的病理作用［41-42］。MAPK1作为丝裂原激活蛋白激酶，ATBC诱导的MAPK1功能异常可能导致下游转录因子ELK1的异常激活，进而失调tau蛋白磷酸化水平和神经可塑性调节机制，最终导致学习记忆功能损害［43］。综上，ATBC可与STAT3、EGFR、MMP9、CTSB和MAPK1高亲和力结合，从而影响多个关键细胞信号通路。
GO富集分析结果显示，AD涉及炎症反应、GABA能突触传递失衡、Aβ形成及γ-分泌酶复合物异常、蛋白激酶活性紊乱等关键BP。小胶质细胞炎症激活、GABA抑制性神经元功能缺陷导致兴奋-抑制失衡、蛋白激酶活性下降在AD疾病早期即出现，而TREM2介导的小胶质细胞反应和IFITM3调节的γ-分泌酶活性异常构成了疾病进展的分子基础［44-48］。这表明ATBC可能通过激活炎症反应、破坏GABA能系统平衡、异常调节γ-分泌酶活性以及紊乱蛋白激酶信号网络等机制影响AD病理与生理进程，最终导致认知功能衰退和神经元死亡。
基于KEGG富集分析结果，P值最小的5条富集通路揭示了一个复杂的病理网络机制。其中，神经活性配体-受体相互作用通路作为核心枢纽，通过胆碱能、谷氨酸能和单胺类神经递质系统的失调直接影响AD患者的认知功能［49-50］；逆行性内源性大麻素信号通路则通过CB1/CB2受体介导的神经保护作用和突触可塑性调节发挥关键作用［51-52］；胰岛素抵抗通路通过脑胰岛素信号受损导致神经元能量代谢异常和tau蛋白过度磷酸化［53-54］；GABA能突触通路的功能缺陷造成兴奋-抑制失衡，加剧神经网络的病理性兴奋［55］；而AGE-RAGE信号通路则通过激活核因子-κB、活性氧和炎症通路，加剧Aβ沉积、线粒体功能障碍和突触损伤，驱动AD的病理进程［56］。值得注意的是，这些通路之间存在广泛的机制联系，胰岛素抵抗作为核心驱动因子，不仅直接损害大脑葡萄糖代谢和神经元存活，还通过激活AGE-RAGE信号轴引发持续性神经炎症［57-58］。AGE-RAGE通路的过度激活促进Aβ聚集，破坏血脑屏障完整性，并释放促炎因子，这些炎症介质进一步抑制GABA能突触传递，导致兴奋性/抑制性平衡失调和认知功能下降［45, 59-60］。
本研究存在一定局限性。首先，网络毒理学预测结果有待实验进一步验证ATBC与预测靶点的真实相互作用。其次，未将ATBC的代谢产物纳入整体评价。ATBC进入人体后经肝脏代谢后可产生多种水解与氧化产物，这些物质能在尿液中检出，其生物活性可能与ATBC存在显著差异［9］。由于代谢产物在极性、脂溶性和蛋白结合特性方面的改变，其血脑屏障穿透能力、作用靶点及神经毒性强度均可能发生重要变化。因此，本研究揭示的毒性机制可能主要源于ATBC本身，而其在真实暴露环境中的整体神经毒性风险可能被低估。最后，缺乏剂量-效应关系分析，无法确定ATBC发挥神经毒性的关键剂量范围。未来可建立体外神经细胞模型和AD动物模型，验证关键靶点的调控作用；开展ATBC代谢动力学研究，评估代谢产物的神经毒性；明确剂量-效应关系和安全阈值；基于识别的关键靶点开发神经保护策略；将研究方法推广至其他增塑剂，建立化学品安全性的快速评估体系。
综上所述，本研究基于网络毒理学和分子对接的综合分析，阐释了ATBC诱导AD的复杂毒性机制。研究发现，ATBC通过高亲和力结合STAT3、EGFR、MMP9、CTSB和MAPK1等核心靶点，进而激活神经活性配体-受体相互作用、AGE-RAGE信号通路、胰岛素抵抗等关键信号通路的失调，最终表现为认知功能缺陷，及神经炎症、Aβ沉积等AD典型特征。与传统毒理学研究相比，本研究揭示的化合物-通路-靶点网络更全面地反映了环境污染物发挥毒性作用的机制，研究结果为评估ATBC的神经毒性风险提供了理论基础，也为AD的环境防控及多靶点治疗策略提供了参考。
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