目的  分析m6A调节因子对膀胱癌（bladder cancer, BC）预后的影响，建立预后预测模型。

方法  从癌症基因组图谱（The Cancer Genome Atlas, TCGA）数据库获取397例BC组织的高通量测序数据和对应的临床病理特征数据。在26个m6A调节因子中，采用单因素Cox回归筛选预后相关的m6A调节因子，利用最小绝对值收敛和选择算子（least absolute shrinkage and selection operator, LASSO）Cox回归分析方法构建BC预后预测模型，比较高低风险组总生存期（overall survival, OS）、免疫检查点相关基因和靶向治疗相关基因表达的差异。通过基因集富集分析比较高低风险组中信号通路的富集情况，采用单样本基因富集分析（single sample gene set enrichment analysis, ssGSEA）和估计恶性肿瘤组织中基质和免疫细胞（estimation of stromal and immune cells in malignant tumors using expression data, ESTIMATE）法评估高低风险组免疫细胞浸润水平的差异。

结果  YTHDC1、IGF2BP3、LRPPRC、FTO和ALKBH3是BC独立的预后因素。利用LASSO Cox回归方法基于5个m6A调节因子建立BC预后预测风险模型，Kaplan-Meier分析结果提示高低风险组间OS存在显著差异（P＜0.001），受试者工作特征（receiver operating characteristic, ROC）曲线下面积为0.665。高风险组在趋化因子、NOD样受体、嘌呤代谢、丙酮酸代谢等信号通路富集，具有丰富的免疫细胞浸润特征，PD-L1、CTLA-4、EGFR和KRAS基因表达更高。

结论  本研究基于m6A调节因子构建的BC预后预测模型准确性较好，有助于临床上预后判断和分层个体化治疗。

膀胱癌（bladder cancer, BC）是常见的男性泌尿系统恶性肿瘤之一。2020年全球BC新发病例数超过55万，死亡病例数超过20万[1]。在中国，BC发病率位居全部恶性肿瘤的第13位，严重威胁男性的生命健康[2-3]。根据是否侵犯膀胱肌层，BC可分为非肌层浸润性和浸润性。非肌层浸润性BC患者首选经尿道膀胱肿瘤切除术联合膀胱内治疗，术后生活质量较好，但约30%患者存在局部浸润或远处转移可能[4]。对于浸润性BC，约25%患者伴有淋巴结转移，5%出现远处转移，预后较差[5]。近年来，随着免疫治疗的应用，BC患者预后有所改善，但由于肿瘤异质性，并非所有BC患者均能从中获益[6-7]。因此，探究BC发生发展的分子机制对提高BC患者治疗反应率意义重大。

N6-甲基腺嘌呤（N6-methyladenosine, m6A）是在RNA腺嘌呤残基的第6位含氮碱基位置上添加一个甲基基团，是真核生物中最丰富的表观转录组学修饰[8]。研究发现，m6A修饰主要由m6A调节因子，即编码器-甲基转移酶复合物、消码器-去甲基化酶和读码器-m6A读取蛋白调控[9]。有研究指出，m6A调节因子具有免疫调节功能，可影响肿瘤微环境（tumor microenvironment, TME）中免疫细胞浸润，并对免疫治疗疗效产生影响[10]。目前，m6A调节因子对BC预后影响的相关研究较少。本研究利用预后相关的m6A调节因子构建BC预后预测模型，评估TME中免疫细胞浸润情况，进一步预测免疫治疗和靶向治疗的疗效，为BC的临床治疗提供参考。

1 资料与方法

1.1 RNA测序转录组数据和临床数据获取

利用癌症基因组图谱（The Cancer Genome Atlas, TCGA）数据库（https://www.cancer.gov/ccg/research/genome-sequencing/tcga），获取397例BC组织的高通量转录组测序数据和对应的临床病理特征数据。397例BC患者的临床病理特征见表1。

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  表格1 397例BC患者的临床病理特征

  Table 1.Clinical and pathological characteristics of 397 patients of BC

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1.2 预后相关的m6A调节因子筛选

检索中国知网、Pubmed、Embase数据库，中文检索词包括m6A调节因子、m6A修饰，英文检索词包括m6A RNA methylation、m6A regulatory factors。共筛选到26个m6A调节因子，包括9个编码器（WTAP、ZC3H13、RBM15、METTL3、RBM15B、KIAA1429、METTL5、METTL14、METTL16）、14个读码器（LRPPRC、HNRNPA2B1、IGF2BP1、IGF2BP2、IGF2BP3、YTHDF1、YTHDF2、YTHDF3、HNRNPC、FMR1、ELAVL1、YTHDC1、YTHDC2、RBMX）和3个消码器（ALKBH5、FTO、ALKBH3）。通过R软件corrplot包计算26个m6A调节因子之间表达的相关性，利用survival包对26个m6A调节因子进行单因素Cox回归分析，结果通过forestplot包输出，筛选预后相关的m6A调节因子。

1.3 预后预测模型构建及验证

利用最小绝对值选择与收缩算子（least absolute selection and shrinkage operator, LASSO）Cox回归，筛选出5个预后相关m6A调控因子（P＜0.05），构建预后预测模型。每例BC患者的风险评分等于5个m6A调控因子中每个基因表达量乘以系数之和（Coefi为风险系数，Xi为基因表达量）。计算公式如下：风险评分=  [11]。分别计算397例BC患者的风险评分，根据中位风险评分分为高风险组和低风险组，比较两组间5年生存差异。绘制受试者工作特征（receiver operating characteristic curve, ROC）曲线并计算ROC曲线下面积（area under ROC curve, AUC），评估所构建预后预测模型的预测价值。利用单因素Cox回归和多因素Cox回归评估预后预测模型和临床病理特征对BC预后的影响。

1.4 基因集富集分析和免疫浸润分析

在上述构建的BC预后预测模型中，通过MSigDB数据库（http://www.broadinstitute.org/gsea/msigdb/index.jsp）获取京都基因与基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes, KEGG）相关通路基因集，利用R软件GSVA包对高风险组和低风险组进行富集分析，明确两组KEGG相关信号通路。利用聚类分析和单样本基因集富集分析（single sample gene set enrichment analysis, ssGSEA）[12]评估高风险组和低风险组中23种免疫细胞类型的频率差异，并计算免疫细胞的相对浸润丰度。利用估计恶性肿瘤组织中基质和免疫细胞（estimation of stromal and immune cells in malignant tumors using expression data, ESTIMATE）方法评估高风险组和低风险组中每个样本中免疫、基质成分及两者之和在TME中的比例，即Immune分数、Stromal分数和Estinate分数。

1.5 基因相关性分析

利用R软件limma包，比较高风险组和低风险组在免疫检查点相关基因PD-L1和CTLA- 4[13]、靶向治疗相关基因HER-2[14]、BRAF[15]、KRAS[16]和EGFR[17]的表达差异，绘制箱式图，以P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 预后相关m6A调节因子筛选

本研究纳入397例BC组织样本。利用R软件分析26个m6A调节因子在BC中表达水平之间的相关性，结果显示除IGF2BP2与YTHDC1、IGF2BP2与METTL3，以及ALKBH3与FMR1外，大部分m6A调节因子之间的表达存在显著正相关性，其中HNRNPC与HNRNPA2B1的正相关性最强（r=0.66），见图1-A、图1-B。为进一步筛选与BC预后相关的m6A调节因子，参考Feng等[18]的研究，通过单变量Cox回归发现YTHDC1、IGF2BP3、LRPPRC、FTO和ALKBH3是BC独立的预后因素，其中IGF2BP3、LRPPRC、FTO和ALKBH3为危险调节因子，其高表达与较差的预后有关，而YTHDC1为保护调节因子，其高表达与较好的预后有关，见图2。

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  图1 BC中m6A调节因子表达相关性

  Figure 1.Correlation of m6A regulator expression in BC

  注：A. 26个m6A调节因子表达的相关性热图；B. 26个m6A调节因子表达的相关性圈图。

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  图2 BC中m6A调节因子单因素Cox回归分析

  Figure 2.Univariate Cox regression analysis of m6A regulators in BC

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2.2 构建BC预后预测模型

利用上述筛选的YTHDC1、IGF2BP3、LRPPRC、FTO和ALKBH3，通过LASSO Cox回归方法建立BC预后预测模型，见图3-A。在模型中，YTHDC1、IGF2BP3、LRPPRC、FTO和ALKBH3的系数分别为-0.08、0.12、0.03、0.19和0.03。根据模型计算每例BC患者的风险评分，将患者分为高风险组和低风险组。低风险组的OS显著高于高风险组（P＜0.001），见图3-B。利用ROC曲线分析预后模型预测BC患者5年生存率的准确性，结果显示AUC值为0.665。

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  图3 基于m6A调节因子构建BC风险预后模型

  Figure 3.Prognostic risk model of BC based on m6A regulators

  注：A. LASSO Cox回归模型构建预后预测模型；B. 高风险组和低风险组生存分析。

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2.3 预后预测模型的临床价值

绘制YTHDC1、IGF2BP3、LRPPRC、FTO和ALKBH3在高风险组和低风险组中的表达量及与临床特征的热图，结果显示其表达量在临床分期中的差异有统计学意义，见图4。单因素Cox回归和多因素Cox回归分析结果显示，年龄、临床分期和风险评分与OS相关（P＜0.001），均为BC独立的预后影响因素，见表2。

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  图4 基于5个m6A调节因子构建的预后模型与临床特征的关系热图

  Figure 4.Heatmap of the relationship between prognostic model based on five m6A regulators and clinical characteristics

  注：***P＜0.001，**P＜0.01。

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  表格2 BC预后预测模型与临床特征的关系

  Table 2.Relationship between BC prognostic prediction model and clinical characteristics

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2.4 基因集富集分析

基因集富集分析结果显示，高风险组在趋化因子、NOD样受体、嘌呤代谢、丙酮酸代谢等信号通路富集，而低风险组在药物代谢细胞色素P450、亚油酸代谢、α-亚麻酸代谢等信号通路富集，见图5。

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  图5 BC预后预测模型的功能富集分析

  Figure 5.Functional enrichment analysis of prognostic risk model in BC

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2.5 免疫浸润分析

采用ssGSEA评估高风险组和低风险组中23种免疫细胞类型的频率差异，结果发现高风险组免疫细胞浸润程度显著高于低风险组，特别是激活的CD4⁺T细胞、激活的CD8⁺T细胞、激活的B细胞、嗜酸性粒细胞、激活的树突细胞、Th1细胞、Th17细胞、中性粒细胞等，提示高风险组和低风险组具有不同的免疫细胞浸润特征，见图6-A。ESTIMATE计算高风险组和低风险组中每个样本中免疫、基质成分及两者之和在TME中的比例，发现高风险组Immune分数、Stromal分数和Estinate分数均高于低风险组，见图6-B。上述结果表明高风险组的TME为免疫炎症型，具有丰富的免疫细胞浸润。

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  图6 BC预后预测模型的免疫浸润分析

  Figure 6.Immune infiltration analysis of prognostic risk model in BC

  注：A. ssGSEA分析；B. ESTIMATE分析；***P＜0.001。

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2.6 基因相关性分析

进一步分析免疫检查点相关基因PD-L1和CTLA-4、靶向治疗相关基因HER-2、BRAF、KRAS和EGFR在高风险组和低风险组之间的表达差异，结果发现PD-L1、CTLA-4、EGFR和KRAS在高风险组中表达更高，HER-2和BRAF在低风险组表达更高，差异均有统计学意义（P＜0.05），见图7。以上结果提示高风险组可能对PD-L1抑制剂、CTLA-4抑制剂、EGFR抑制剂和KRAS抑制剂更敏感，而低风险组可能对HER2抗体和BRAF抑制剂更敏感。

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  图7 高低风险组间免疫检查点相关基因和靶向治疗相关基因表达差异

  Figure 7.Differences in the expression of immune checkpoint related genes and targeted therapy related genes between high and low risk group

  注：A. PD-L1基因；B. CTLA-4基因；C. KRAS基因；D. EGFR基因；E. HER-2基因；F. BRAF基因。

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3 讨论

BC是一种来源于膀胱黏膜的恶性肿瘤。手术和放化疗是其主要的治疗方式，然而即使接受标准治疗，仍有50%~70%患者出现复发或转移，晚期和转移性BC的治疗效果不理想[5]。目前BC仍缺乏特异性预后标志物，因此，探究新型预后预测标志物并建立预后预测模型对治疗BC具有重要的临床价值。

m6A调节因子的异常表达可能影响肿瘤的发生发展[9]。随着m6A修饰研究领域的不断突破，越来越多的新m6A调节因子被发现。本研究分析了26个m6A调控因子表达的相关性，发现BC中m6A调节因子之间的表达存在显著相关性。进一步筛选与BC预后相关的m6A调节因子，单变量Cox回归结果显示YTHDC1、IGF2BP3、LRPPRC、FTO和ALKBH3是BC独立的预后因素。IGF2BP3和IGF2BP1同属IGF2BP家族，是m6A阅读蛋白的一种。有研究证实IGF2BP3在BC组织内的高表达，可通过调节HMGB1信号通路促进BC的发展，进而影响BC患者预后 [19]。周子健等通过临床标本验证了BC组织内IGF2BP1的高表达可提示BC患者预后不良，转染IGF2BP1 siRNA后BC细胞的增殖和生长被显著抑制[20]。脂肪量和肥胖相关蛋白FTO在多种癌症组织中表达，刺激肿瘤细胞代谢，诱导肿瘤细胞浸润和进展。苏甲林通过检测24例BC组织及癌旁正常组织FTO的表达，发现与对应癌旁组织相比，BC组织中FTO相对低表达，且与病理分期分级呈负相关[21]。

近年来，有研究利用m6A调节因子建立头颈鳞癌[22]、肝癌[23]、结直肠癌[24]的预后预测模型，并验证发现其具有较好的预测价值，可以指导后续临床治疗。Wu等分析了23个m6A调节因子与临床病理特征和预后的相关性，提示m6A调节因子可以作为BC预后评估的潜在分子靶点[25]。Chen等分析了13个m6A调节因子在BC中的表达情况，并选择FTO、YTHDC1和WTAP构建预后预测模型[26]。Zheng等利用FTO和YTHDF2评估BC预后预测模型的应用价值[27]。本研究纳入了更多m6A调控因子，更全面地探讨了m6A修饰对BC预后预测的价值。通过Cox回归模型选择5个m6A调节因子（YTHDC1、IGF2BP3、FTO、ALKBH3和LRPPRC）建立BC预后预测模型，ROC曲线检测风险评分预测BC患者5年生存率的准确性，结果显示AUC值为0.665。本研究与Zheng等[27]建立的模型（5年AUC=0.614）相比，5年AUC值更高，进一步分析发现Zheng等[27]利用单因素Cox筛选预后相关m6A调节因子时设置筛选标准为P＜0.15，最后纳入预后模型构建的YTHDF2（P=0.112）对BC患者预后的影响较小，本研究将筛选标准设置为P＜0.05，以确保参与模型构建的每个m6A调节因子都与BC预后相关。另外，按照风险评分将BC患者分为高风险组和低风险组，经过单因素Cox回归及多因素Cox回归发现年龄、临床分期和风险评分与OS相关，是BC独立的预后影响因素。

m6A调节因子具有免疫调节功能，可影响TME中免疫细胞浸润，并对免疫治疗疗效产生影响[10]。利用ssGSEA和ESTIMATE法比较高风险组和低风险组中免疫细胞浸润水平的差异，结果发现，两组具有不同的免疫细胞浸润特征，高风险组具有丰富的免疫细胞浸润，其TME为免疫炎症型，即热肿瘤对免疫治疗疗效更好[28]。

靶向治疗和免疫治疗的快速发展极大程度提高了BC患者的OS，并改善了其预后。但由于肿瘤异质性，并非所有的BC患者均能从靶向治疗和免疫治疗中获益。为了探讨建立的预后预测模型对靶向治疗和免疫治疗的指导作用，本研究选择了免疫检查点相关基因PD-L1和CTLA- 4、靶向治疗相关基因HER-2、BRAF、KRAS和EGFR，比较高风险组和低风险组中这些基因表达的差异，结果发现PD-L1、CTLA-4、EGFR和KRAS在高风险组中表达更高，HER-2和BRAF在低风险组中表达更高，提示高风险组可能对PD-L1抑制剂、CTLA-4抑制剂、EGFR抑制剂和KRAS抑制剂更敏感，而低风险组可能对HER2抗体和BRAF抑制剂更敏感，间接预测了高低风险组患者对免疫治疗和靶向治疗的疗效差异。本研究存在一定局限性，仅分析了TCGA数据库，未进行临床试验验证。

综上所述，本研究利用5个m6A调节因子在BC中构建预后预测模型并验证其临床应用价值，评估预后预测模型中免疫细胞浸润程度，该模型可能成为评估BC患者是否适合免疫治疗和靶向治疗的参考指标，为临床医师的治疗选择提供依据。

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