目的  探寻脂肪肉瘤的预后生物标志物，以作为其潜在的治疗靶点。

方法  从基因表达综合数据库（Gene Expression Omnibus，GEO）中下载GSE21122、GSE159659及GSE30929数据集，采用R语言limma包鉴定脂肪肉瘤与正常脂肪组织间的显著差异基因，利用ggvenn包获得共同差异基因。利用survival和survminer包进行Cox回归分析和Kaplan-Meier生存分析。采用corr.text函数分析ADIPOQ与多种免疫检查点分子的相关性。利用clusterProfiler包对高低表达ADIPOQ脂肪肉瘤之间的差异表达基因进行功能富集分析。

结果  在GSE21122和GSE159659数据集中，分别鉴定出155个和39个显著差异基因。Venn图显示存在25个共同差异基因。多因素Cox回归分析结果显示，ADIPOQ可作为脂肪肉瘤预后良好的独立因素[HR=0.68，95%CI（0.49，0.94），P=0.022]。与正常脂肪组织相比，ADIPOQ在脂肪肉瘤组织中显著低表达（P ＜0.001）。Kaplan-Meier生存分析结果显示，高表达ADIPOQ脂肪肉瘤患者的无远处复发生存期（distant recurrence free survival，DRFS）显著高于低表达组（P＜0.001）。Spearman相关性分析结果显示，ADIPOQ与ICOS、TNFSF9、LAG3、CTLA4、CD47、CD200、CD86、PDCD1LG2等免疫检查点分子量呈负相关关系（P＜0.05）。基因本体（Gene Ontology，GO）和京都基因与基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）分析结果显示，高低表达ADIPOQ脂肪肉瘤之间的上调基因在营养物质代谢及相关通路中富集，下调基因在细胞分裂、细胞周期等生物学功能中富集。

结 论  ADIPOQ可作为脂肪肉瘤患者预后良好的生物标志物，其可能具有抑制多种免疫检查点表达的作用，从而改善脂肪肉瘤患者的预后。

软组织肉瘤是一种起源于间充质组织的罕见异质性肿瘤，约占所有恶性肿瘤的1%，其包含50多种组织学亚型,而脂肪肉瘤约占所有软组织肉瘤病例的20%[1-3]。目前，局限性脂肪肉瘤的治疗以根治性手术切除为主，也可联合放射治疗,以有效降低肿瘤复发和死亡的风险[4]。对于无法切除或已发生转移者，蒽环类化疗药物的全身性治疗已作为标准一线治疗方案，但脂肪肉瘤的整体化疗敏感性仍较低[5]。分子靶向药物的面世改善了多种恶性肿瘤的预后，但其在软组织肉瘤的治疗中并未获得显著疗效[6]。因此，新型预后生物标志物的鉴定显得较为重要，其可能成为脂肪肉瘤的潜在治疗靶点。本研究采用生物信息学的方法探寻与脂肪肉瘤预后显著相关的生物标志物，并探索ADIPOQ在脂肪肉瘤中与多种免疫检查点的关系，为今后脂肪肉瘤分子靶向治疗提供一定的参考。

1 资料与方法

1.1 数据来源

基于基因表达综合数据库（Gene Expression Omnibus，GEO）[7]（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/）下载GSE21122、GSE159659及GSE30929数据集。从GSE21122数据集获取89例脂肪肉瘤组织和9例正常脂肪组织的mRNA测序数据；从GSE159659数据集获取30例脂肪肉瘤组织和15例脂肪组织的mRNA测序数据；GSE30929数据集包含140例脂肪肉瘤组织的mRNA测序数据及其所对应患者的无远处复发生存期（distant recurrence survival, DRFS）等预后信息。

1.2 脂肪肉瘤组织和正常脂肪组织之间差异基因筛选

运用R语言limma包[8]分别从GSE21122和GSE159659数据集获取脂肪肉瘤组织和正常脂肪组织之间的显著差异基因，其筛选标准设为|log2 fold change（logFC）|＞2和adjusted P＜0.05，火山图绘制由R语言ggplot2包[9]实现。利用ggvenn包制作韦恩图，获得二者的共同差异基因。

1.3 基于共同差异基因进行Cox回归分析

将所获得的共同差异基因作为自变量，对GSE30929数据集中140例脂肪肉瘤患者进行Cox回归分析。首先对每个基因进行单因素Cox回归分析，从中选取与预后显著相关的基因（P ＜0.05）。然后运行step函数进行逐步回归，在不违背比例风险假定的前提下进行多因素Cox回归分析。Cox回归分析由R语言survival和survminer包实现，可视化分析由forestplot包实现。

1.4 脂肪肉瘤组织中ADIPOQ的表达水平及Kaplan-Meier生存分析

采用R Studio软件分别读取GSE21122和GSE159659数据集中样本的ADIPOQ表达数据，分析脂肪肉瘤组织与正常脂肪组织之间ADIPOQ的表达差异，结果由R语言ggplot2包实现可视化。依据GSE30929数据集中140例脂肪肉瘤组织ADIPOQ表达量的中位值，将其分为ADIPOQ高表达组和低表达组，利用R语言survival和survminer包进行Kaplan-Meier生存分析。

1.5 脂肪肉瘤组织中ADIPOQ与多种免疫检查点的相关性分析

从GSE30929数据集140例脂肪肉瘤组织的基因表达数据中筛选得到VTCN1、ICOS、TNFSF14、TNFSF9、LAG3、LGALS9、CTLA4、SIRPA、CD47、CD200、CD96、CD86、CD80、CD28、PDCD1LG2及PDCD1共16种免疫检查点的表达情况，采用corr.text函数将其与ADIPOQ进行Spearman相关性分析，从而筛选出与ADIPOQ相关性显著的免疫检查点，进一步分析其在ADIPOQ高表达组和低表达组之间的表达差异，结果均由ggplot2包进行可视化。

1.6 高低表达ADIPOQ脂肪肉瘤之间差异表达基因的功能富集分析

利用R语言limma包获取GSE30929数据集中70例ADIPOQ高表达与70例ADIPOQ低表达脂肪肉瘤组织之间的差异表达基因，筛选标准设为|log2 fold change （logFC）|＞1和adjusted P＜0.05，并绘制火山图。利用clusterProfiler包分别对上调和下调的差异基因进行基因本体（Gene Ontology，GO）生物学过程和京都基因与基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）富集分析，将q-value＜0.05作为显著性富集的阈值。

1.7 统计学方法

所有统计学分析均由R语言（v 4.2.1）完成。两组间比较采用Wilcoxon秩和检验，Kaplan-Meier生存分析采用log-rank检验，相关性分析采用Spearman相关系数检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 脂肪肉瘤组织和正常脂肪组织之间的差异基因

在GSE21122数据集中，脂肪肉瘤组织与正常脂肪组织之间被鉴定出27个显著上调的基因和128个显著下调的基因，见图1-A；在GSE159659数据集中，共获取3个显著上调的基因和36个显著下调的基因，见图1-B。Venn图结果显示，脂肪肉瘤组织和正常脂肪组织存在25个共同差异基因，见图1-C、图2-A。

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  图1 脂肪肉瘤组织和正常脂肪组织之间差异表达基因筛选

  Figure 1.The screening of differentially expressed genes between liposarcoma tissue and normal adipose tissue

  注：A. GSE21122数据集中脂肪肉瘤组织与正常脂肪组织之间的差异表达基因；B. GSE159659数据集中脂肪肉瘤组织与正常脂肪组织之间的差异表达基因；C. Venn图。

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2.2 单因素和多因素Cox回归分析

通过单因素Cox回归分析，从25个差异基因中筛选出与脂肪肉瘤患者预后显著相关的基因共20个：ADIPOQ、MT1E、PRELP、CALB2、FOSB、SLC19A3、GPD1、HBB、RBP4、CIDEC、S100B、LEP、FHL1、GYG2、MAOA、PRKAR2B、AQP7、PLIN1、ADH1B、FABP4，见图2-A。然后通过逐步回归法自动选择出最优模型，其自变量包含ADIPOQ、MT1E、GPD1、HBB、RBP4、CIDEC、LEP、GYG2、PRKAR2B、FABP4。运用cox.zph函数验证Cox回归模型的比例风险假定，结果显示各自变量的检验和全局检验的P值均大于0.05，表示没有违背比例风险的假定，见图2-B。最后构建多因素Cox回归模型，结果显示ADIPOQ基因可作为脂肪肉瘤预后良好的独立因素[HR=0.68，95%CI（0.49，0.94），P=0.022]；此外，基因MT1E、GYG2、FABP4也分别与脂肪肉瘤预后具有相关性，见图2-C。

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  图2 差异表达基因在脂肪肉瘤患者中的单因素和多因素Cox回归分析

  Figure 2.Univariate and multivariate Cox regression analysis for the differentially expressed genes in patients with liposarcoma

  注：A. 单因素Cox回归分析；B. Cox回归模型比例风险假定的验证；C. 多因素Cox回归模型构建。

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2.3 ADIPOQ在脂肪肉瘤组织中的表达水平和Kaplan-Meier生存分析

在GSE21122数据集中，脂肪肉瘤组织中ADIPOQ表达量较正常脂肪组织显著降低（P ＜0.001），见图3-A；在GSE159659数据集中，脂肪肉瘤组织中ADIPOQ表达量较脂肪组织同样表现为显著降低（P＜0.001），见图3-B。通过Kaplan-Meier生存分析，进一步验证了高表达ADIPOQ的脂肪肉瘤患者比ADIPOQ低表达者拥有更长的DRFS（P＜0.001），见 图3-C，这与Cox回归分析结果一致。

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  图3 脂肪肉瘤中ADIPOQ的表达水平及Kaplan-Meier生存分析

  Figure 3.The expression level and Kaplan-Meier survival analysis of ADIPOQ in liposarcoma

  注：A. GSE21122数据集中脂肪肉瘤与正常脂肪组织之间ADIPOQ的表达差异；B. GSE159659数据集中脂肪肉瘤与正常脂肪组织之间ADIPOQ的表达差异；C. Kaplan-Meier生存分析。

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2.4 脂肪肉瘤中ADIPOQ与多种免疫检查点的相关性分析

Spearman相关性分析结果显示，脂肪肉瘤中ADIPOQ与多种免疫检查点呈显著负相关，包括ICOS、TNFSF9、LAG3、CTLA4、CD47、CD200、CD86、PDCD1LG2等，见图4-A。同时，与在ADIPOQ低表达组中的表达相比，上述免疫检查点在ADIPOQ高表达组中均呈现出显著低表达，见图4-B。以上结果提示在脂肪肉瘤中，ADIPOQ可能具有抑制多种免疫检查点表达的作用，从而改善患者预后。

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  图4 脂肪肉瘤中ADIPOQ与多种免疫检查点的相关性

  Figure 4.Correlation between ADIPOQ and multiple immune checkpoints in liposarcoma

  注：A. ADIPOQ与多种免疫检查点的相关性分析；B. ADIPOQ高低表达组之间免疫检查点的表达差异；*P＜0.05，**P＜0.01，***P ＜0.001。

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2.5 高低表达ADIPOQ脂肪肉瘤之间差异表达基因的功能富集分析

高表达ADIPOQ与低表达ADIPOQ脂肪肉瘤之间被鉴定出145个显著上调的基因和48个显著下调的基因，见图5-A。GO和KEGG富集分析显示，上调基因在营养物质代谢及相关通路中富集，见图5-B、图5-C；下调基因参与细胞分裂、细胞周期等生物学功能，见图5-D；KEGG分析结果显示，下调基因未发现任何富集显著通路。以上揭示了脂肪肉瘤中与ADIPOQ相关的潜在生物学功能和调控通路。

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  图5 高低表达ADIPOQ脂肪肉瘤之间差异表达基因的功能富集分析

  Figure 5.Functional enrichment analysis of differentially expressed genes between liposarcoma with high and low ADIPOQ

  注：A. GSE30929数据集中高表达与低表达ADIPOQ脂肪肉瘤之间的差异表达基因；B. 上调基因的GO分析；C. 上调基因的KEGG分析；D. 下调基因的GO分析。

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3 讨论

近年来，新型分子靶向药物的出现已显著改善了许多实体恶性肿瘤的预后[10]，但脂肪肉瘤的靶向药物临床试验尚未显现出明显疗效。因此，探寻脂肪肉瘤的新型预后生物标志物具有重要意义。本研究获取了脂肪肉瘤与正常脂肪组织之间的显著差异基因，并从中鉴定出4个与脂肪肉瘤的DRFS显著相关的基因：ADIPOQ、MT1E、GYG2、FABP4，其中ADIPOQ已被认为与脂肪肉瘤的分化程度相关[11]，因此将其作为本研究的焦点基因。

脂联素由ADIPOQ基因控制表达，是一种主要由脂肪细胞产生的脂肪细胞因子，可促进脂肪酸氧化和增加葡萄糖摄取[12-13]。ADIPOQ已被发现与某些恶性肿瘤的预后相关。Hou等的研究表明，血清脂联素水平下降会增加患乳腺癌的风险，并与淋巴结转移有关[14]。有研究报道了脂联素在体外对Colon26、DLD-1、HCT116、HT- 29、Lo Vo和SW620等结直肠癌细胞具有抗增殖作用[15-19]。此外，脂联素与前列腺癌的肿瘤分期和Gleason分级呈显著负相关[20-21]。本研究首次探索了ADIPOQ与脂肪肉瘤预后的关系。Cox回归分析结果表明，ADIPOQ可作为脂肪肉瘤预后良好的独立因素；与正常脂肪组织相比，ADIPOQ在脂肪肉瘤中呈显著低表达；Kaplan-Meier生存分析进一步验证了ADIPOQ可能是脂肪肉瘤潜在预后良好的生物标志物。免疫检查点分子具有抑制免疫细胞活化及其功能的作用，在正常机体中可以防止自身免疫对健康组织造成过度损害；但在癌症中，免疫检查点的过度表达会抑制免疫细胞的抗肿瘤作用，而肿瘤细胞利用这种机制可以实现免疫逃逸[22-25]。因此，免疫检查点疗法在恶性肿瘤治疗中具有较大潜力。本研究发现，ADIPOQ与ICOS、TNFSF9、LAG3、CTLA4、CD47、CD200、CD86、PDCD1LG2等多种免疫检查点基因均呈负相关关系，提示ADIPOQ可能具有抑制这些免疫检查点分子表达的作用，从而改善脂肪肉瘤患者的预后。为进一步探索ADIPOQ在脂肪肉瘤中的生物学功能，本研究对高低表达ADIPOQ脂肪肉瘤之间的差异表达基因进行GO和KEGG富集分析，发现上调基因主要在营养物质代谢及相关通路中富集，下调基因主要在细胞分裂、细胞周期等生物学功能中富集，这提示ADIPOQ可能作为关键基因在脂肪肉瘤的细胞代谢过程中发挥重要作用，亦可能通过抑制细胞的分裂活动和细胞周期来阻滞肉瘤的进展。本研究存在一定局限性，仅利用GEO公共数据进行分析，未来有待开展体内或体外实验进一步验证ADIPOQ在脂肪肉瘤中的预后价值和靶向治疗前景。

综上所述，本研究发现ADIPOQ可作为脂肪肉瘤患者潜在预后良好的生物标志物，其可能具有抑制多种免疫检查点表达的作用，从而改善脂肪肉瘤患者的预后。

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