目的  利用GWAS数据进行双向双样本孟德尔随机化（Mendelian randomization，MR）分析，探究自身免疫性肝病（autoimmune liver disease，AILD）与糖尿病（diabetes mellitus，DM）的因果关联性。

方法  从IEU数据库下载AILD和1型糖尿病（type 1 diabetes mellitus，T1DM）的GWAS数据，从DIAGRAM联合会下载2型糖尿病（type 2 diabetes mellitus，T2DM）的GWAS数据，提取合格的单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism，SNP）。采用MR-Egger回归、加权中位数（weighted median estimator，WME）和逆方差加权（inverse variance weighted，IVW）方法进行MR分析。通过异质性检验、多效性分析、留一法分析和MR-PRESSO分析验证结果的稳健性。

结果  IVW分析结果显示，原发性胆汁性胆管炎（primary biliary cholangitis，PBC）与T1DM呈正相关关系（OR=1.244，95%CI：1.137~1.361，P＜0.001）。反向MR分析结果显示，T1DM显著增加自身免疫性肝炎（autoimmune hepatitis，AIH）（OR=1.111，95%CI：1.053~1.173，P＜0.001）、PBC（OR=1.218，95%CI：1.133~1.310，P＜0.001）、原发性硬化性胆管炎（primary sclerosing cholangitis, PSC）（OR=1.375，95%CI：1.187~1.592，P＜0.001）的发病风险。未观察到AILD与T2DM间存在显著的因果关系。异质性检验提示SNP之间存在异质性，故采用随机效应IVW模型进行MR分析。多效性分析未提示存在水平多效性。留一法分析表明，去除每个SNP后，因果关系保持一致。通过MR-PRESSO分析发现离群值，去掉离群值重新进行MR分析，其结果变化不大，进一步证实了结果的可靠性。

结论  PBC与T1DM间存在双向因果关系，T1DM患者发生AIH、PSC的风险增加，未观察到AILD与T2DM间存在显著的因果关系。

自身免疫性肝病（autoimmune liver disease，AILD）是一组免疫介导的、病因尚不明确的自身免疫性疾病，主要包括自身免疫性肝炎（autoimmune hepatitis，AIH）、原发性胆汁性胆管炎（primary biliary cholangitis，PBC）和原发性硬化性胆管炎（primary sclerosing cholangitis，PSC），其发病率近年来逐渐升高[1-2]。糖尿病（diabetes mellitus，DM）是全球最常见的慢性非传染性疾病之一，其患病率呈逐年上升趋势，2021年全球有近5.29亿DM患者[3]。DM病程长，并发症多，其发病趋于年轻化，且多脏器严重损害并发症对人类健康和社会发展具有重要影响。1型糖尿病（type 1 diabetes mellitus，T1DM）是最常见的自身免疫性疾病之一，以胰岛素缺乏和高血糖为特征。2型糖尿病（type 2 diabetes mellitus，T2DM）占糖尿病的90%以上，主要由胰岛素分泌不足和胰岛素抵抗引起，肥胖是其首要危险因素。

既往研究发现，AILD患者发生DM的风险增加[4-7]，然而二者间的因果关系并不明确。由于传统观察研究在方法上的局限性，包括混杂因素、反向因果关系和测量误差，这种关联可能存在偏差[8]。孟德尔随机化（Mendelian randomization， MR）是一种新型遗传流行病学分析方法，将单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism，SNP）作为暴露的工具变量（instrumental variables，IVs）用以评估暴露与结果间的因果关系。本研究采用双向双样本MR分析探讨AILD与DM间的潜在因果关系，以期临床尽早发现和治疗DM，制定AILD患者相关的预防策略。

1 资料与方法

1.1 研究设计

本研究将AIH、PBC和PSC作为暴露，将T1DM、T2DM作为结局，将SNP作为IVs。用于MR分析的IVs需要满足以下3个假设：①相关性：IVs与暴露显著相关；②独立性：IVs与影响暴露-结局关联的任何混杂因素均无关联；③排他性：IVs仅通过暴露影响结局，不与结局直接相关。研究设计见图1。

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  图1 研究设计

  Figure 1.Study design

  注：MR研究基于三个假设：（1）IVs与暴露强相关；（2）IVs独立于已知或未知的混杂因素；（3）IVs仅通过暴露因素影响结局。

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1.2 数据来源

通过IEU OpenGWAS project（https://gwas.mrcieu.ac.uk/）获取T1DM、AIH、PBC和PSC的GWAS数据[9-11]。所有AIH、PBC病例均符合美国肝病研究协会标准。PSC的GWAS数据来源于国际PSC研究小组（the International PSC Study Group，IPSCSG），该联盟是全球最大的PSC遗传数据库 [12]，PSC的诊断基于临床、生化、胆管造影和组织学标准，并排除继发性硬化性胆管炎。T2DM的GWAS研究数据来自糖尿病遗传学复制和荟萃分析联盟（DIAbetes Genetics Replication And Meta-analysis Consortium，DIAGRAM consortium）的大规模病例对照GWAS统计[13]，具体信息见表1。为避免人群分层带来的偏倚，结局和暴露纳入的样本均来自欧洲人群，包含男性与女性，并尽量减少样本重叠。

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  表格1 GWAS数据简要信息

  Table 1.Summary information of GWAS data

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1.3 选择合格的IVs

基于前述基本假设，本研究根据以下标准 [14]选择IVs：①设置P＜5×10^-8初步筛选出与AILD显著相关的SNP；AIH筛选出的SNP数量为1，设置P＜5×10^-6重新筛选；②为保证IVs是独立遗传的，排除具有连锁不平衡（linkage disequilibrium，LD）的SNP（相关系数R2=0.001，遗传距离=10 000 kb）；③在结局数据中提取上述与AILD相关的SNP，并进行数据合并，去除模糊SNP与回文SNP，删去最小等位基因频率（minor allele frequency，MAF）小于0.01的SNP；④计算每个SNP的F统计量，测量其作为IVs的强度，计算公式：，r²表示该SNP解释AILD的程度，N代表AILD样本大小，K代表SNP的个数。其中，r²=2×MAF×（1-MAF）×β2，β为AILD的等位基因效应 值。F＜10的弱工具变量将被剔除；⑤使用PhenoScanner V2数据库（http://www.phenoscanner.medschl.cam.ac.uk/）手动剔除与HLA、肥胖或结局相关的SNP。经过上述筛选，剩余的SNP被认为是合格的工具变量。

1.4 统计分析

1.4.1 MR分析

使用3种MR分析方法评估AILD与DM间是否存在因果关系，分别为MR-Egger回归、加权中位数（weighted median estimator，WME）和逆方差加权（inverse variance weighted，IVW）[15-17]。其中，IVW是最主要的分析方法。使用公式β=ln（OR）将β值转换为比值比（odds ratio，OR）。

1.4.2 可靠性评价

使用以下方法评估结果的稳健性[18]：①异质性检验：采用考克兰Q检验（Cochran's Q test）评估SNP之间的异质性；若P＞0.05，则认为不存在显著异质性，采用固定效应IVW模型；若P ＜0.05，则采用随机效应IVW模型；②多效性分析：使用MR-Egger回归的截距（MR-Egger intercept）[19]评估水平多效性，P＞0.05表示截距不存在，即不存在多效性，可认为不存在混杂因素；③敏感性分析：采用留一法（leave-one-out analysis）进行敏感性分析，即依次剔除每个SNP，并使用IVW方法对剩余SNP的效应进行分析[20]，以评估MR结论是否依赖于某一SNP；④应用MR-PRESSO进行离群值检验[21]，删去异常SNP后重新进行MR分析，比较结果是否有变化。

1.4.3 反向因果关系的MR分析

为探索DM与AILD发病的因果关系，将暴露与结局的数据集互换，进行双向MR分析。从T1DM、T2DM的GWAS数据中提取显著且独立遗传、无连锁不平衡的SNP，在AILD数据集中提取结局信息，再按照上述方法进行MR分析与敏感性分析。

1.4.4 统计分析

采用TwoSampleMR软件包（v 0.5.8）和R软件（v 4.3.2）进行统计分析，分析结果用OR和95%置信区间（95% confidence interval，95%CI）表示，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 AILD对T1DM、T2DM的因果效应

在T1DM数据集中选取37个与PBC相关的SNP，MR分析结果显示，PBC的遗传变异与T1DM存在因果关系。IVW结果显示，PBC的存在可能增加20.6%的T1DM患病风险（OR=1.244，95%CI：1.137~1.361，P＜0.001）。IVW结果未提示AIH（OR=1.320，95%CI：0.984~1.771， P=0.064）、PSC（OR=1.039，95%CI：0.789~1.368，P=0.783）与T1DM之 间，AIH（OR=1.005，95%CI ：0.982~1.029，P=0.649）、PBC（OR=1.004， 95%CI ：0.985~1.023，P=0.688）、PSC（OR=0.986，95%CI ：0.960~1.014，P=0.335）与T2DM之间存在因果关系，见表2。

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  表格2 AILD与DM关联的MR分析结果

  Table 2.Results of MR analysis of the association between AILD and DM

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2.2 T1DM、T2DM对AILD的因果效应

以DM为暴露，以AILD为结局，探究DM对AILD的因果关系。IVW结果显示，T1DM与AIH（OR=1.111，95%CI ：1.053~1.173，P ＜0.001）、 PBC（OR=1.218，95%CI：1.133~1.310，P＜0.001）、PSC（OR=1.375，95%CI：1.187~1.592，P＜0.001）存在因果关系（表3），可认为T1DM能增加AIH、PBC与PSC的发病风险（图2）。IVW结果未提示T2DM与AIH（OR=1.058，95%CI：0.935~1.198， P=0.373）、PBC（OR=0.968，95%CI ：0.853~1.098，P=0.613）、PSC（OR=0.884，95%CI ：0.765~1.021，P=0.094）之间存在因果关系。

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  表格3 DM与AILD关联的MR分析结果

  Table 3.Results of MR analysis of the association between DM and AILD

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  图2 MR分析散点图

  Figure 2.Scatter plot of MR analysis

  注：A. PBC增加T1DM发病风险；B. T1DM增加AIH发病风险；C. T1DM增加PBC发病风险；D. T1DM增加PSC发病风险。

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2.3 敏感性分析

若Cochran's Q检验显示上述MR分析中存在显著异质性，结果采用随机效应IVW模型。MR-Egger intercept提示不存在水平多效性（P＞0.05）。留一法结果表明无明显的偏倚SNP，见图3。采用MR-PRESSO对上述数据进行分析，发现离群值后去掉离群值重新进行MR分析，MR结果变化不大，进一步证实了结论的可靠性。

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  图3 留一法分析结果

  Figure 3.Results of leave-one-out analysis

  注：A. PBC与T1DM；B. T1DM与AIH；C. T1DM与PBC；D. T1DM与PSC。

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3 讨论

AILD的特征为失调的免疫反应损伤肝细胞或胆管细胞，所造成的持续肝脏炎症可能导致肝脏纤维化增加，若不及时诊断和治疗，可能进展为肝硬化、肝衰竭[22-24]。目前AILD尚缺乏治愈性治疗，现常用的药物治疗效果有限，安全有效的新型药物仍有待研发，以期延缓疾病进展、改善预后。T1DM的特征为免疫介导的胰腺细胞破坏导致胰岛素分泌绝对缺乏，目前常采用皮下注射胰岛素的方式控制患者血糖，胰腺、干细胞移植治疗尚需进一步研究；T2DM的特征为胰岛素抵抗伴随胰岛β细胞功能损伤所致的胰岛素分泌相对减少，二者的发病机制尚未完全阐明。

既往研究表明，AILD患者发生T1DM、T2DM的风险均增加。Jensen等采用英国生物库数据进行病例对照研究，纳入328例AIH患者和345例PBC患者，结果显示发生T1DM和T2DM的风险显著增加；Meta分析提示AIH、PBC和PSC患者中T1DM的患病率高于2021年全球一般人群中T1DM的患病率；与对照组相比，AIH、PBC和PSC患者中T2DM的患病率显著增加[4]。一项队列研究显示，PSC患者罹患T1DM、T2DM的风险增加[5]。一项中国的回顾性研究表明，T2DM是中国PBC的主要代谢风险因素之一[25]。然而，并发DM是否影响AILD的预后尚未有定论。

本研究采用双向双样本MR分析探究AILD与DM间的潜在因果关系，IVW方法将每个SNP的Wald比率进行逆方差加权回归，从而评估暴露与结局的因果关系，当每个SNP满足三大基本假设时，它能提供最准确的估计值[15]。MR-Egger回归方法仅需IVs满足相关性和独立性即可估计因果效应，其截距能评估IVs之间的多效性，但结果的精确度和统计效能也相应降低，因此，当MR分析结果MR-Egger的P值大于0.05，而其他方法P值小于0.05且beta值方向一致时，以IVW方法为准[16]。WME方法将所有SNP按照效应值权重排序后计算得到的加权中位数作为因果效应估计值，即使无效IVs占50%，它仍能提供有效的结果，是最稳健的一种方法[17]。本研究结果显示，PBC的存在可能增加20.6%的T1DM发病风险，反向MR分析结果提示T1DM能增加AIH、PBC与PSC的发病风险，并未观察到AILD与T2DM之间存在因果关系。本研究尚未得出与既往研究一致的结论，可能是由于AILD的病例数不足，尽管本研究选择了样本量较大的数据集，但AILD作为罕见疾病，其GWAS数据仍有待进一步扩充；其次，尽管T2DM的GWAS数据样本量较大，但未对性别、年龄、疾病严重程度等进行分层，因此无法进行相应的亚组分析，从而得出更准确的结论。

本研究从遗传学角度探讨AILD与T1DM间的因果关系。T1DM和AILD均为自身免疫性疾病，由遗传、免疫和环境因素共同影响，其中遗传因素起重要作用，二者有相同的风险基因位点。人类白细胞抗原（human leukocyte antigen，HLA）等位基因DRB1*03：01在欧洲人群中与AIH相关，同时增加T1DM的发病风险，肿瘤坏死因子α诱导蛋白3（TNFAIP3）是AIH和T1DM的共同易感基因，参与氧化应激和DNA修复[26]。HLA-DRB1、信号转导和转录活化因子4（STAT4）是PSC和T1DM的共同易感基因[27]。HLA-DRB1*0301-DQA1*0501-DQB1*0201（DR3）增加了PSC和T1DM的发病风险，由此提示AILD与T1DM可能通过相似的分子机制影响机体[28]。

根据孟德尔定律，等位基因在减数分裂时期随机分配，且不随疾病而改变，MR的基本原则是利用遗传变异作为自然的随机化实验来评估暴露对结果的因果效应，因此，MR分析可减少传统观察性研究中常见的环境暴露等混杂因素和测量误差，降低反向因果关系的影响，从而使结果更有说服力。同时，本研究采用GWAS数据进行MR分析，具有样本量大、统计效能高的优势。本研究存在一定局限性：首先，GWAS数据集来源于欧洲人群，本研究结果对亚洲人群的适用性仍未可知，为证实本研究的结论，需要进一步收集亚洲地区的GWAS数据；其次，AILD的GWAS样本量较少，筛选出的SNP数量有限，仅能解释部分变异，因此存在假阴性可能；最后，双样本MR分析仅从遗传学角度说明AILD与T1DM两种疾病间存在因果关联，二者间的作用机制有待进一步探究。

综上，本研究通过双向双样本MR方法分析AILD与DM间的因果关系，结果表明PBC与T1DM间存在双向因果关系，T1DM患者发生AIH、PSC的风险增加，未观察到AILD与T2DM间存在显著的因果关系。

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