目的  研究丝氨酸蛋白酶抑制剂1（serine proteinase inhibitor family E member 1，SERPINE1）在结肠癌转移过程中对基质金属肽酶-9（matrix metallopeptidase-9，MMP- 9）和基质金属肽酶-2（matrix metallopeptidase-2，MMP-2）的影响。

方法  构建过表达与干扰表达SERPINE1的慢病毒载体后转染细胞，通过starBase数据库中RNA-RNA共表达分析结肠癌中SERPINE1与MMP-9和MMP-2表达的关系，并应用Western Blot实验明确SERPINE1对MMP-2和MMP-9表达的调控；最后通过划痕实验和Transwell实验评估SERPINE1对结肠癌细胞转移的影响。

结果  SERPINE1过表达与干扰表达的慢病毒载体构建成功，通过starBase数据库RNA-RNA共表达分析发现在结肠癌中的MMP-9和MMP-2的表达与SERPINE1的表达呈显著正相关（P＜0.01，r值分别为0.467和0.664），Western Blot实验发现过表达SERPINE1组结肠癌细胞MMP-9和MMP-2的表达高于对照组；反之，干扰表达SERPINE1组MMP-9和MMP-2的表达低于对照组，应用ImageJ软件进行灰度值相对定量分析，差异均有统计学意义（P＜0.05）。在RKO和LoVo细胞中过表达SERPINE1后细胞的迁移和侵袭能力增强（P＜0.01）；反之，干扰表达SERPINE1后细胞的迁移和侵袭能力减弱（P ＜0.05）。

结论  SERPINE1可能通过调控MMP-9和MMP-2来影响结肠癌细胞的转移。

结直肠癌是我国发病率仅次于肺癌的第二大肿瘤，2022年新发病例达51.7万/年，5年生存率低于欧美发达国家；2000—2018年，我国结直肠癌发病率呈逐年上升趋势，其中男性发病率和死亡率增长幅度显著，疾病负担持续加重[1-3]。近年来，虽然有了新的治疗方案，但转移性结直肠癌的5年生存率仍然较低，不足20%[4-5]。结肠癌是结直肠癌的主要类型，迫切需要寻找结肠癌诊治的靶分子，以便及早发现、及时诊治，从而改善患者预后。丝氨酸蛋白酶抑制剂1（serine proteinase inhibitor family E member 1，SERPINE1）属于丝氨酸蛋白酶抑制剂家族的一员，参与多种病理生理过程[6]。大量研究表明，SERPINE1与肿瘤的发生、发展密切相关，且其在不同肿瘤或同一肿瘤的不同时期似乎发挥着抑癌与促癌的双重功能[7-8]。前期本课题组通研究发现SERPINE1在结直肠癌中异常表达，且与患者预后相关，并且调控结肠癌细胞增殖、迁移、侵袭及凋亡的恶性生物学行为，进一步研究发现SERPINE1可能通过调控MKI67表达和Bax/Bcl-2的比值影响结肠癌细胞的增殖与凋亡[9-11]。为明确SERPINE1在结肠癌细胞转移过程中发挥的生物学功能，已有研究发现SERPINE1的表达与细胞外基质的降解相关 [12]。多项研究表明肿瘤细胞的转移与细胞外基质降解蛋白相关，如MMP-9与MMP-2的表达可促进肿瘤细胞侵袭和迁移[13-15]。本研究首先构建过表达和干扰表达的SERPINE1慢病毒载体；然后通过starBase数据库进行RNA-RNA共表达分析筛选出基质金属肽酶-9（matrix metallopeptidase-9，MMP-9）和基质金属肽酶-2（matrix metallopeptidase-2，MMP- 2）并通过Western Blot实验验证，最后通过划痕实验和Transwell实验评估SERPINE1对结肠癌细胞转移的影响。

1 材料与方法

1.1 数据库

通过starBase数据库进行RNA-RNA共表达分析，探讨结肠癌中SERPINE1的表达与MMP-9及MMP-2的相关性。

1.2 实验材料

结肠癌细胞：LoVo细胞株由甘肃省干细胞基因与药物重点实验室赠予（货号：FH0023、上海富衡生物科技有限公司），RKO细胞株购自上海富衡生物科技有限公司。

1.3 主要试剂及仪器

胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）购于上海瑟欧生物科技有限公司；培养基DMEM和1640及胰酶购自赛默飞世尔科技（中国）有限公司；过表达和干扰表达SERPINE1慢病毒载体购自上海吉玛制药技术有限公司（编号分别为LV8N、C06003）；RNA反转录和扩增试剂盒购自北京宝日医生物技术有限公司；结晶紫染色液、RIPA组织/细胞裂解液、蛋白上样缓冲液、嘌呤霉素、SDS-PAGE制胶盒、电泳缓冲液及电转缓冲液、脱脂奶粉、TBST、BCA蛋白浓度检测试剂盒和4%多聚甲醛购于北京索莱宝科技有限公司；Matrigengel基底膜基质购于上海诺娃医药科技有限公司；RNA提取试剂盒、青霉素-链霉素溶液、抗体稀释液和ECL发光液购于上海碧云天生物技术有限公司；SERPINE1引物合成来自北京擎科生物科技股份有限公司西安分部，内参引物购于湖南艾克瑞生物工程有限公司；SERPINE1一抗购于武汉三鹰生物技术有限公司；MMP-9、MMP-2一抗购于江苏亲科生物研究中心有限公司；GAPDH一抗、二抗购于杭州华安生物技术有限公司。

恒温培养箱购于赛默飞世尔科技（中国）有限公司；酶标仪购于瑞士帝肯有限公司；荧光显微镜购于日本奥林巴斯株式会社；qPCR扩增仪购自美国应用生物系统公司；电泳/电转仪购于上海伯乐生命医学产品有限公司。

1.4 细胞培养、转染及稳转株筛选

RKO细胞株和LoVo细胞株分别用DMEM和1640完全培养基培养（基础培养基中加入1%青霉素-链霉素溶液和10% FBS配制成完全培养基），培养条件为37 ºC，5% CO2。

选取生长良好的对数生长期待感染靶细胞，根据预实验选取合适的感染复数（multiplicity of infection，MOI）值加入适量的慢病毒载体。感染24 h后换液，待感染72 h后荧光显微镜初步观察感染效果，然后加入含适量浓度嘌呤霉素的完全培养基，定期换液，进行稳转株筛选。培养7 d后收集细胞进行RT-qPCR和Western Blot鉴定，以确认目的基因表达水平，并将鉴定合格的细胞用于后续实验。

1.5 RT-qPCR实验

选取对数生长期待测细胞，应用RNA提取试剂盒进行总RNA提取，选取纯度和浓度合格的样本进行RNA反转录，接着进行RT- qPCR扩增，最后采用2-∆∆Ct方法进行相对定量分析并绘制柱状图。引物序列：SERPINE1正向引物：5'-CCGCCGCCTCTTCCACAAATC-3'，SERPINE1反向引物：5'-TAGGGCAGTTCCAGGA TGTCGTAG-3'；GAPDH正向引物：5'-GCACCG TCAAGGCTGAGAAC-3'，GAPDH反向引物：5'- TGGTGAAGACGCCAGTGGA-3'。

1.6 Western Blot实验

选取对数生长期待测细胞，加入适量RIPA裂解液，提取总蛋白，用BCA法检测蛋白浓度。制作10% SDS-PAGE凝胶电泳分离10 μg总蛋白后，将条带转移至聚偏二氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜上，用5%脱脂奶粉常温封闭2  h。随后，一抗（一抗SERPINE1稀释比例为1  ∶ 1 000、一抗GAPDH为1 ∶ 20 000）孵育4  ℃冰箱内摇床过夜；孵育完成后进行TBST洗膜，然后将PVDF膜置于二抗中常温摇床孵育2  h。TBST洗膜后进行PVDF膜显影，并通过ImageJ软件进行灰度值计算，做定量分析绘制柱状图（一抗SERPINE1稀释比例为1 ∶ 1 000，一抗GAPDH稀释比例为1 ∶ 20 000，二抗HRP结合山羊抗兔IgG抗体稀释比例为1 ∶ 50 000）。

1.7 划痕实验

采用划痕实验检测细胞的横向迁移能力。使用较细的马克笔在6孔板的底面画3条平行线作为标记线。将处于对数生长的靶细胞消化后均匀接种于6孔板内，待细胞融合度在80%左右时用10 μL移液枪枪头制造划痕。PBS清洗后更换低血清培养基（含2% FBS），并于0 h、12 h、24 h和48 h定时拍照。计算细胞迁移率=（0 h划痕宽度-培养后划痕宽度）/0 h划痕宽度×100%。

1.8 Transwell实验

通过Transwell板进行跨井迁移实验；评估细胞的纵向迁移能力。提前12 h和将处在对数期生长的靶细胞换用无FBS培养基培养；在Transwell下层小室接种含20% FBS的完全培养基600 μL，将饥饿细胞进行消化、用无FBS培养基重新制备悬液，接种于Transwell的上层小室，每孔100 μL（约5×10⁴个），接种完毕后将培养板放入培养箱中孵育36 h；孵育完成后上室加入4%多聚甲醛200 μL固定，结晶紫染色，PBS漂洗晾干后于高倍显微镜下拍照。随机选取5个视野，做定量分析并绘制柱状图。

1.9 Transwell侵袭实验

提前3 h将Matrigengel基底膜基质铺于Transwell上室底部（详细步骤参照说明书）。后续实验操作同Transwell纵向迁移实验。

2 统计学方法

采用GraphPad Prism 8.0.2及SPSS 26.0软件进行统计分析。计量资料以（）表示，两组比较采用独立样本t检验，P＜0.05表示差异有统计学意义。

3 结果

3.1 过表达及干扰表达SERPINE1慢病毒载体构建及测序验证

根据National Center for Biotechnology Information（NCBI）Gene数据库公布的SERPINE1核苷酸序列（Gene ID 5054），设计特异性过表达和干扰表达片段，由苏州吉玛基因有限公司（上海）合成过表达和干扰靶点序列，见表1。

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  表格1 过表达和干扰基因片段序列

  Table 1.Sequence of the overexpression and interference gene fragments

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过表达SERPINE1慢病毒载体选用苏州吉玛基因有限公司（上海）的LV8N，目的基因启动子为EF-1a，荧光标签为mCherry，真核抗性为Puromycin（图1-A）；干扰表达SERPINE1慢病毒载体选用苏州吉玛基因有限公司（上海）的LV3，目的基因启动子为H1，荧光标签为GFP，真核抗性为Puromycin（图1-B）。为验证SERPINE1基因过表达和干扰表达载体插入序列与设计序列一致，委托苏州吉玛基因有限公司（上海）对过表达和干扰表达的载体序列进行基因测序鉴定。通过鉴定结果可知过表达和干扰表达SERPINE1慢病毒载体序列插入成功，与设计合成的序列一致（图1-C、图1-D）。

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  图1 过表达和干扰表达基因载体结构示意图和插入序列鉴定

  Figure 1.Schematic representation of the structure of the expression vector and identification of the insert sequence

  注：A. 过表达载体结构示意图；B. 干扰表达载体结构示意图；C. 设计过表达SERPINE1的序列与载体测序结果鉴定；D. 设计干扰表达SERPINE1的序列与载体测序结果鉴定。

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3.2 SERPINE1过表达和干扰表达效率验证

为验证过表达和干扰表达SERPINE1慢病毒载体转染结肠癌细胞后，其过表达和干扰表达的效果，采用RT-qPCR和Western Blot实验验证目的基因SERPINE1的表达情况。RT-qPCR实验结果显示，在RKO和LoVo细胞株中，转染过表达慢病毒载体（oe-LV8N-SERPINE1）后，与对照组（oe-LV8N-NC）相比，oe-LV8N-SERPINE1组SERPINE1表达升高（P＜0.05，图2-A1、图2-C1）；转染干扰表达慢病毒载体（sh-LV3-SERPINE1）后，与对照组（sh-LV3-NC）相比，sh-LV3-SERPINE1组的SERPINE1表达显著降低（P＜0.01，图2-B1、图2-D1）。Western Blot实验结果显示，在RKO和LoVo细胞株中转染oe-LV8N-SERPINE1慢病毒载体后，与对照组（oe-LV8N-NC）相比，oe-LV8N-SERPINE1组SERPINE1表达升高，灰度值量化分析差异有显著统计学意义（P＜0.000 1，图2-A2、图2-C2）；转染sh-LV3-SERPINE1慢病毒载体后，与对照组（sh-LV3-NC）相比，sh-LV3-SERPINE1组的SERPINE1表达降低，灰度值量化分析差异有显著统计学意义（P＜0.000 1，图2-B2、图2-D2）。通过RT-qPCR和Western Blot实验验证过表达和干扰表达SERPINE1成功，可满足后续实验需要。

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  图2 转染不同慢病毒载体后SERPINE1的表达

  Figure 2.Expression of SERPINE1 after transfection with different lentiviral vectors

  注：A1、B1、C1、D1为RT-qPCR实验检测转染不同慢病毒载体后mRNA表达；A2、B2、C2、D2为Western Blot实验检测转染不同慢病毒载体后蛋白表达。*P﹤0.05、**P﹤0.01、***P﹤0.001、****P﹤0.000 1。

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3.3 SERPINE1对MMP-9和MMP-2的影响

通过starBase数据库中RNA-RNA共表达模块，分析在结肠癌中SERPINE1表达与MMP- 9、MMP-2表达的相关性，结果显示，MMP-9与MMP-2表达与SERPINE1表达呈显著正相关（P ＜ 0.01，r值分别为0.467和0.664），见图3-A、图3-B。通过Western Blot实验验证在结肠癌细胞RKO和LoVo细胞株进行慢病毒转染过表达和干扰表达SERPINE1载体后对MMP-9、MMP-2表达的影响，结果显示，在结肠癌的RKO细胞株中过表达SERPINE1后MMP-9、MMP-2表达升高，干扰表达SERPINE1后其表达降低；同样在结肠癌的LoVo细胞株中过表达和干扰表达SERPINE1后表现出相似的趋势（图3-C）。应用ImageJ软件进行灰度值相对定量分析，发现过表达和干扰表达SERPINE1后，MMP-9和MMP-2的表达差异均有统计学意义（P＜0.05，图3-D—图3-G）。

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  图3 过表达和干扰表达SERPINE1对MMP-9和MMP-2的影响

  Figure 3.The effect of overexpression and interference expression of SERPINE1 on MMP-9 and MMP-2

  注：A、B. 基于starBase数据库分析SERPINE1与MMP-9、MMP-2共表达关系；C. 通过Western Blot检测转染不同慢病毒载体后SERPINE1表达对MMP-9、MMP-2表达的影响；D、E、F、G为采用ImageJ软件进行灰度值量化分析SERPINE1表达对MMP-9、MMP-2表达的影响。*P﹤0.05、**P ﹤0.01、***P﹤0.001、****P﹤0.000 1。

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3.4 SERPINE1对结肠癌细胞横向迁移能力的影响

通过划痕实验检测细胞的横向迁移能力，并对细胞的横向迁移率进行量化，评估过表达和干扰表达SERPINE1后对细胞横向迁移的影响。结果显示：在RKO细胞株中，转染过表达（oe-LV8N-SERPINE1）和干扰表达（sh-LV3-SERPINE1）慢病毒载体后，oe-RKO-SERPINE1组细胞的横向迁移能力强于对照组（oe-RKO-NC），sh-RKO-SERPINE1组细胞的横向迁移能力弱于对照组（sh-RKO-NC），见图4-A1、图4-B1；同样，在LoVo细胞株中，转染过表达（oe-LV8N-SERPINE1）和干扰表达（sh-LV3-SERPINE1）慢病毒载体后，oe-LoVo-SERPINE1组细胞的横向迁移能力强于对照组（oe-LoVo-NC），sh-LoVo-SERPINE1组细胞的横向迁移能力弱于对照组（sh-LoVo-NC），见图4-C1、图 4-D1）。通过量化各组细胞的横向迁移率进行差异性分析发现，相较于对照组，在RKO和LoVo细胞株中过表达和干扰表达SERPINE1组，在12 h、24 h、48 h细胞的横向迁移率差异均有显著统计/学意义（P＜0.01，图4-A2—图4-D2）。

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  图4 过表达和干扰表达SERPINE1对结肠癌细胞横向迁移能力的影响

  Figure 4.The effect of overexpression and interference expression of SERPINE1 on the transmigration ability of colon cancer cells

  注：A1、B1. RKO细胞株过表达及干扰表达SERPINE1后对细胞横向迁移影响；A2、B2. RKO细胞株过表达及干扰表达SERPINE1后对细胞横向迁移率的定量分析；C1、D1. LoVo细胞株过表达及干扰表达SERPINE1后对细胞横向迁移的影响；C2、D2. LoVo细胞株过表达及干扰表达SERPINE1后对细胞横向迁移率的定量分析。**P﹤0.01、***P﹤0.001、****P﹤0.000 1。

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3.5 SERPINE1对结肠癌细胞纵向迁移能力的影响

通过Transwell实验检测细胞的纵向迁移能力，并量化细胞的相对迁移面积，检测过表达和干扰表达SERPINE1后对细胞纵向迁移的影响。结果显示，在RKO细胞株中转染过表达（oe-LV8N-SERPINE1）和干扰表达（sh-LV3-SERPINE1）慢病毒载体后，oe-RKO-SERPINE1组细胞的纵向迁移能力强于对照组（oe-RKO-NC），sh-RKO-SERPINE1组细胞的纵向迁移能力弱于对照组（sh-RKO-NC），见图5-A1；同样，在LoVo细胞株中转染过表达（oe-LV8N-SERPINE1）和干扰表达（sh-LV3-SERPINE1）慢病毒载体后，oe-LoVo-SERPINE1组细胞的纵向迁移能力强于对照组（oe-LoVo-NC），sh-LoVo-SERPINE1组细胞的纵向迁移能力弱于对照组（sh-LoVo-NC），见图5-B1。通过量化各组细胞的纵向迁移面积进行差异性分析发现，相较于对照组，在RKO和LoVo细胞株中过表达和干扰表达SERPINE1组细胞的纵向迁移面积差异均有显著统计学意义（P＜0.001），见图5-A2、图5-B2。

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  图5 过表达和干扰表达SERPINE1对结肠癌细胞纵向迁移能力的影响

  Figure 5.The effect of overexpression and interference expression of SERPINE1 on the longitudinal migration ability of colon cancer cells

  注：A1. RKO细胞株过表达和干扰表达SERPINE1后对细胞纵向迁移的影响；A2. RKO细胞株过表达和干扰表达SERPINE1后对细胞纵向迁移面积的定量分析；B1. LoVo细胞株过表达和干扰表达SERPINE1后对细胞纵向迁移的影响；B2. LoVo细胞株过表达和干扰表达SERPINE1后对细胞纵向迁移面积的定量分析。***P﹤0.001、****P﹤0.000 1。

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3.6 SERPINE1对结肠癌细胞侵袭功能的影响

在Transwell上室包被Matrigengel基底膜基质，建立细胞侵袭模型，通过Transwell实验检测细胞的侵袭能力并量化细胞的相对侵袭面积，评估过表达和干扰表达SERPINE1后对细胞侵袭能力的影响。结果显示，在RKO细胞株中，转染过表达（oe-LV8N-SERPINE1）和干扰表达（sh-LV3-SERPINE1）慢病毒载体后，oe-RKO组细胞的侵袭能力强于对照组（oe-RKO-NC），sh-RKO-SERPINE1组细胞的侵袭能力弱于对照组（sh-RKO-NC），见图6-A1。同样，在LoVo细胞株中转染过表达（oe-LV8N-SERPINE1）和干扰表达（sh-LV3-SERPINE1）慢病毒载体后，oe-LoVo组细胞的侵袭能力强于对照组（oe-LoVo-NC），sh-LoVo-SERPINE1组细胞的侵袭能力弱于对照组（sh-LoVo-NC），见图6-B1。通过量化各组细胞的侵袭面积进行差异性分析发现，相较于对照组，在RKO和LoVo细胞株中过表达和干扰表达SERPINE1组细胞的侵袭面积差异均有统计学意义（P＜0.01），见图6-A2、图 6-B2。

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  图6 过表达和干扰表达SERPINE1后对结肠癌细胞侵袭能力的影响

  Figure 6.Effect of overexpression and interference expression of SERPINE1 on the in-vasiveness of colon cancer cells

  注：A1. RKO细胞株过表达和干扰表达SERPINE1后对细胞侵袭的影响；A2. RKO细胞株过表达和干扰表达SERPINE1后对细胞侵袭面积的定量分析；B1. LoVo细胞株过表达和干扰表达SERPINE1后对细胞侵袭的影响；B2. LoVo细胞株过表达和干扰表达SERPINE1后对细胞侵袭面积的定量分析。*P﹤0.05、**P﹤0.01。

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4 讨论

结肠癌是结直肠癌中最常见的一种类型，是世界上发病率和死亡率最高的癌症之一。仅2020年全球新发结肠癌患者约114.9万例，死亡患者约57.7万例[16]。受遗传和环境等多重因素影响，结肠癌的发病机制复杂多样。尽管早期结肠癌患者5年生存率可达90%，但由于缺乏特异性诊断生物标志物，早期不易被发现，超过60%的患者发现时已发展至肿瘤晚期且大多已转移，存活率不足10%[17-19]。此外，治疗后复发也是结肠癌治疗的难题，有研究报道称其复发率高达50%[20]。分子生物学基础研究及应用技术的不断发展，为结肠癌的诊治带来了新的希望。

有研究表明，SERPINE1在出凝血、细胞黏附与扩散、伤口损伤修复及肿瘤的发生发展等方面发挥着多种生物学功能，探讨其在肿瘤中所发挥的作用已成为近年来的研究热点之一。早在上世纪90年代Lee等[21]发现血浆中纤溶酶原激活物抑制剂-1（plasminogen activator inhibitor-1，PAI-1）缺乏将导致纤溶亢进性出血，SERPINE1在凝血和纤溶机制间的平衡中发挥着独特作用；Planus等[22]的研究发现尿激酶与SERPINE1结合后可介导细胞黏附与扩散；Chan[23]和Providence[24]等的研究发现SERPINE1可促进伤口损伤修复。近年来，越来越多的研究发现其在肿瘤的发生与进展过程中发挥着重要功能，如参与肿瘤微环境的重塑，促进肿瘤血管的生成，增强肿瘤细胞的耐药性、放射抗性，参与肿瘤细胞的增殖、凋亡、迁移和侵袭等[25-29]。

此外，有研究采用生物信息学分析发现，SERPINE1在结肠癌组织中高表达，且其表达与肿瘤的浸润深度、淋巴结转移、远处转移和TNM分期显著相关[30]。Wang等[31]的研究发现SERPINE1在结肠癌微环境的重塑和免疫细胞的浸润中发挥作用。基于以上研究，提示SERPINE1在结肠癌的发生与进展中可能发挥着重要功能。本课题组进一步研究发现，过表达SERPINE1促进结肠癌细胞增殖、迁移、侵袭，抑制其凋亡，干扰SERPINE1表达可以抑制结肠癌细胞增殖、迁移、侵袭，促进其凋亡，并调控增殖标志物ki-67、凋亡相关蛋白Bax和Bcl-2的表达[10-11]。然而，Mao等[32]发现SERPINE1表达上调后抑制了前列腺癌细胞的迁移，与本研究结论相反，表明SERPINE1可能在不同组织的癌细胞中发挥了不同生物学功能，提示了其在调控癌细胞的迁移中可能发挥着促癌或抑癌的双重作用。Kim等[33]发现抗血小板治疗可增加分泌型SERPINE1表达，诱导基质金属肽酶-1（matrix metallopeptidase-1，MMP-1）表达并促进结肠癌转移，而本研究发现SERPINE1与MMP-9、MMP-2表达正相关。MMP-2、MMP-9属于锌离子依赖性内肽酶家族成员，基质金属肽酶具有维持组织稳态和驱动病理变化的双重角色，尤其通过降解细胞外基质、参与组织重塑和破坏，以及调控细胞微环境来影响肿瘤细胞的恶性生物学行为。刘等[34]的研究发现miR-532-3p靶向SERPINE1调控细胞外基质受体互作通路，抑制结肠腺癌细胞增殖和迁移，也印证了本研究结果SERPINE1促进结肠癌细胞的迁移和侵袭。其分子机制可能是SERPINE1通过调控PI3K/AKT信号通路、细胞外基质降解或调控血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）信号通路，进而促进MMP-2、MMP-9表达，最终促使结肠癌细胞的转移[10, 12, 35]。

综上所述，SERPINE1可能通过调控MMP-9、MMP-2来影响结肠癌细胞的转移。本研究仍存在一定局限性，未进行体内动物实验验证，且未探索 SERPINE1 与其他细胞转移相关分子的相互作用，未来研究可纳入更多相关分子以更全面地考察其影响。

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