目的  观察胃癌（gastric cancer，GC）组织、血浆和细胞系中ARMC8（armadillo repeat containing protein 8）的表达水平，探究ARMC8对GC细胞侵袭、迁移及上皮间充质转化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）的分子机制。

方法  通过GEPIA数据库对408例GC组织和211例正常胃组织中的ARMC8的表达进行差异分析；通过实时荧光定量聚合酶链反应（quantitative real-time PCR，qRT-PCR）检测ARMC8在GC患者血浆及正常人血清的相对表达量；在2种GC细胞系（HGC-27、AGS）和1种正常胃黏膜上皮细胞（GES-1）中进一步验证ARMC8的表达情况。通过转染si-ARMC8及阴性对照实现下调GC细胞中 ARMC8的表达水平。随后，采用Transwell细胞侵袭实验、伤口愈合实验检测GC细胞的侵袭和迁移能力；用WB检测下调ARMC8的表达对EMT相关蛋白及Wnt/β-catenin信号通路的影响。

结果  ARMC8在GC组织、血浆及GC细胞系中均为高表达。Transwell侵袭实验和伤口愈合实验显示，下调ARMC8抑制了GC细胞的侵袭和迁移能力。此外，下调ARMC8抑制了GC细胞EMT过程及Wnt/β-catenin信号通路的激活。

结论  ARMC8在GC组织、血浆及细胞系中均呈高表达，下调ARMC8可能通过抑制Wnt/β-catenin信号通路的激活来抑制GC的侵袭、迁移和EMT过程。

胃癌（gastric cancer，GC）是一种起源于胃上皮细胞的恶性肿瘤，发病率在全世界所有类型癌症中排列第五，仅次于肺癌、乳腺癌、结直肠癌和前列腺癌，同时也是癌症相关死亡率的第三大原因[1]。目前中晚期GC患者首选的治疗方法仍是手术切除，尽管现在GC的手术方法和策略取得了很大进展，但患者的预后仍不理想，术后局部区域复发和远处转移的发生率仍较高，且与肿瘤分期呈正相关[2-3]。转移和复发仍是GC有效治疗的主要障碍，严重影响GC患者的预后。因此，探究GC进展的相关分子机制，开发新的治疗靶点对改善GC患者预后、降低死亡率非常重要。

ARMC8（armadillo repeat containing protein 8）是犰狳重序列蛋白家族（ARMCs）的一员，是一种在脊椎动物中高度保守的犰狳蛋白质[4]。ARMC8参与多种细胞生物学功能，包括细胞迁移、增殖、黏附、信号转导和肿瘤发生等[5]。目前越来越多关于ARMC8的研究集中在肿瘤细胞侵袭和转移方面[6-10]。研究表明ARMC8在卵巢癌和结肠癌组织中高表达，其表达水平与淋巴结转移、晚期TNM分期及不良预后显著相关，敲低ARMC8表达可抑制癌细胞的迁移能力，但其调控癌细胞转移的机制尚未阐明[7,10]。近年来有研究发现，ARMC8在骨肉瘤细胞、膀胱癌和皮肤鳞状细胞癌的恶性进展中都显示出与上皮-间充质转化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）密切关联[11-13]。EMT是上皮细胞重新分化为间充质细胞的过程，已被证实与GC的转移、侵袭、化疗抵抗等密切相关[14]。因此，抑制细胞进入EMT期或逆转EMT期至间充质到上皮转化可作为肿瘤控制和预防的有效策略[15]。然而，ARMC8在GC中的表达以及是否参与调节EMT尚未报道。

本研究旨在了解ARMC8在GC组织、血浆及细胞中的表达情况，观察ARMC8对GC细胞侵袭和转移能力的影响，探索ARMC8是否调控EMT及其调控机制，以期为GC进展中的分子机制研究提供新的方向。

1 材料与方法

1.1 GC组织数据分析

采用GEPIA数据库对GC组织和正常组织在ARMC8的表达水平上进行差异分析，该数据库包括408个GC样本和211个正常样本。

1.2 临床样本收集

收集GC患者血浆22例、健康人血浆20例。GC血浆来源于武汉市第三医院组织活检确诊为GC的患者，所有病人均未行放、化疗。以同期健康体检者作为对照组。血浆标本均在空腹采血后2 h内经4℃ 1 600 g离心10 min，提取上层血浆后立即置于-80℃保存。本研究经武汉市第三医院伦理委员会批准（2021-013）。

1.3 细胞系

正常人胃黏膜GES-1细胞和人GC细胞株，包括HGC-27和AGS，由中国科学院细胞型培养库（中国上海）提供。GES-1细胞在高糖DMEM中培养，HGC-27细胞在RPMI-1640中培养，AGS细胞在Ham's F-12K中培养，均补充10%胎牛血清、1%的青-链霉素，细胞在37℃含5%CO₂的加湿培养箱中培养。

1.4 主要试剂和仪器

DMEM培养基、RPMI-1640培养基、Ham's F-12K培养基、胎牛血清、胰酶、转染用OPTI-MEM 培养基均购自美国Gibco公司；ARMC8、GAPDH引物、siRNA转染试剂购自锐博（广州）公司；RNA提取试剂TRIzol、转染试剂Lipofectamine2000（货号：11668019） 购自美国Invitrogen公司；逆转录试剂盒购自日本TOYOBO公司；荧光定量PCR试剂盒购自中国康为世纪公司；Transwell小室购自美国Corning公司；Matrigel 基质胶（货号：356234）购自美国BD公司。BCA蛋白测定试剂盒、ECL化学发光试剂盒购自美国Thermo Fisher公司。抗GAPDH的小鼠单克隆抗体（货号：ab8245）、抗snail的兔单克隆抗体（货号：ab216347）、抗N-catenin的小鼠单克隆抗体（货号：ab98952）、抗E-catenin的小鼠单克隆抗体（货号：ab238099）、抗β-catenin的兔单克隆抗体（货号：ab32572）购自英国Abcam公司；抗cyclin D1的兔抗体（货号：#55506）购自美国CST公司；c-myc抗体（货号：sc-42）购自美国ABclonal公司；ARMC8抗体（货号：12653-1-AP）购自美国Proteintech公司；羊抗鼠IgG（货号：E-AB-1001）和羊抗兔IgG（货号：E-AB-1003）均购自中国Elabscience公司；荧光定量 PCR扩增仪（BIO-RAD）购自美国伯乐公司；荧光倒置显微镜购自日本 OLYMPUS公司。

1.5 siRNA转染

取对数生长期的HGC-27和AGS细胞于6孔板中铺板，培养至细胞融合率达70%，根据Lipofectamine 2000试剂使用说明，将敲除ARMC8基因的siRNA（si-ARMC8组）及阴性对照siRNA（NC组）瞬时转染细胞。细胞继续孵育48 h后提取总RNA，通过qRT-PCR检测转染效率，以确保观察到的生物学变化是由靶基因的表达引起的。si-ARMC8及NC siRNA的序列如下：

si-ARMC8-1

正向：5’-CGGACAGAUGAUAACUGUATT-3’

反向：5’-UACAGUUAUCAUCUGUCCGTT-3’

si-ARMC8-2

正向：5’-GCACUGAAAUGUUUCUCAGTT-3’

反向：5’-CUGAGAAACAUUUCAGUGCTT-3’

si-ARMC8-3

正向：5’-GAGCAAAUGAUGAAGACAUTT-3’

反向：5’-AUGUCUUCAUCAUUUGCUCTT-3’

NC siRNA

正向：5’-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3’

反向：5’-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3’

1.6 检测方法

1.6.1 qRT-PCR检测

参照TRIzol试剂说明书提取细胞的总RNA。采用超微量紫外可见分光光度计检测RNA纯度和浓度。将质量合格的总RNA与逆转录试剂及特异性的ARMC8逆转录引物（GAPDH作为内参）混合，反应体系如下：1 ug RNA，1ul特异性的逆转录引物，EnzymeMix 1ul，5×Reaction buffer 4 ul，用无RNA酶水补足至20 ul，在20 μl反应体系中，37℃ 15 min，100℃ 5 min进行逆转录。然后取1.33 μL逆转录产物cDNA与1 μL引物混合，在20 μL反应体系中，95℃变性10 min；95℃ 15 s，60℃ 60 s，40个循环。以GAPDH作为对照，用2^-△△Ct法检测ARMC8的相对表达量。引物序列如下：

ARMC8：

正向：5’-TCGATGACCCTGGTAAATG-3’

反向：5’-CTGTCCGAATTGCTCCA-5’

GAPDH：

正向：5’-GGGGCTCTCCAGAACATC-3’

反向：5’-TGACACGTTGGCAGTGG-3’

1.6.2 Western blotting检测蛋白表达水平

利用RIPA裂解液（质量浓度为10 g/L的PMSF）裂解细胞，提取总蛋白，用BCA蛋白分析试剂盒根据使用说明测定蛋白浓度，根据分子量大小，用约10%的聚丙烯酰胺凝胶进行电泳分离并将其电转移至PVDF膜，质量浓度为50 g/L       脱脂奶粉室温封闭1 h，分别用抗ARMC8、GAPDH（1 ∶ 10 000稀释）；抗snail、E-cadherin、N-cadherin、c-myc、cyclin D1 （1 ∶ 1 000稀释）及β-catenin （1 ∶ 5 000稀释）的一抗4℃孵育过夜。TBST缓冲液洗涤3次后，室温孵育二抗（1 ∶ 3 000稀释）1 h，洗涤后经ECL底物显色显影，成像仪扫描结果。

1.6.3 细胞侵袭试验

使用孔径为8 μm的24孔Transwell室进行。将Matrigel原液置于冰箱内4℃冰浴过夜，用预冷的枪头使其混匀；用融化的Matrigel原液和预冷无血清的培养液配制Transwell上室凝胶液，以每孔50 µL包被Transwell上室，37℃放置2 h使其成胶。细胞转染48 h后，将细胞用胰蛋白酶消化，并将3×105细胞置于100 ul无血清培养基中，转移至上层基质室，下室添加含10%胎牛血清的培养基作为化学引诱剂，每组设置3个副孔。培养48 h后，取出小室并用PBS清洗2遍，用4%多聚甲醛固定，结晶紫染液染色。在显微镜200倍镜下随机选择高倍视野进行拍照，计数入侵细胞的数量。

1.6.4 伤口愈合实验

将对数生长期的HGC-27和AGS细胞铺板，置37℃含5%CO2的培养箱中生长，直至融合率达70%。按照si-ARMC8使用说明转染入细胞，继续培养至融合率达100%。使用1 mL枪头沿直尺在细胞单层上划两条平行线，用PBS冲洗三次，去除细胞碎片，然后再加入完全培养基培养。在0 h 、12 h、24 h用倒置光学显微镜拍摄图像。图片使用ImageJ软件量化原始划痕内迁移细胞覆盖的剥落距离百分比。

1.7 统计分析

采用 SPSS 22.0软件进行统计学分析，所有实验重复3次。插图数据均采用GraphPad Prism进行。计量资料用均数和标准差（x±s）表示，两组间比较采用t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 ARMC8在GC组织、血浆及GC细胞系中的表达情况

根据GEPIA数据库，评估了408例GC组织和211例胃正常组织的mRNA表达谱。使用基因差异分析ARMC8表达水平的差异（图1A）。结果显示，与正常组织相比，GC组织中ARMC8的表达显著上调。此外，通过qRT-PCR检测了ARMC8在GC患者血浆及细胞系中的表达。相较于健康对照人群，GC患者血浆中ARMC8表达量明显上调（P＜0.01）（图1B）。与正常胃黏膜细胞（GES-1）相比，ARMC8的表达在GC细胞系HGC-27（P＜0.05）和AGS（P＜0.001）中均上调（图1C），进一步的WB结果与qRT-PCR结果相一致，观察到一条代表ARMC8的75.5kDa蛋白条带在两种GC细胞系和正常胃黏膜细胞系中的表达有差异（图1D）。

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  图1 ARMC8在GC组织、GC患者血浆及GC细胞系中的表达情况

  Figure 1.Expression of ARMC8 in GC tissues, the plasma of GC patients and GC cell lines

  注：A. GEPIA数据库中408例GC组织和211例正常胃组织中ARMC8的表达情况；B. qRT-PCR检测GC患者与健康体检者血浆中ARMC8的相对表达量；C、D. qRT-PCR和WB检测GES-1、HGC-27和AGS细胞系中ARMC8 mRNA及蛋白的表达情况。*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001

  

2.2 GC细胞转染效果

对HGC-27细胞进行转染，通过qRT-PCR检测si-ARMC8组与NC组ARMC8的mRNA表达水平，结果显示si-ARMC8组的ARMC8表达水平均低于NC组（P＜0.05）（图2）。

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  图2 HGC-27细胞转染si-ARMC8后ARMC8的表达情况

  Figure 2.Eexpression of ARMC8 in HGC-27 cells after transfecting si-ARMC8

  注：*P＜0.05

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2.3 GC细胞的侵袭与迁移能力

使用伤口愈合实验和Transwell侵袭实验检测GC细胞的迁移和侵袭能力。与NC组相比，si-ARMC8组中的GC细胞在12 h、24 h内伤口愈合率明显更低（P＜0.05）（图3）；si-ARMC8组侵入Matrigel的癌细胞数量明显少于NC组（P＜0.001）（图4）。

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  图3 下调ARMC8后GC细胞的迁移能力

  Figure 3.The migration ability of gastric cancer cells after downregulating ARMC8

  注：*P＜0.05

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  图4 下调ARMC8后GC细胞的侵袭能力

  Figure 4.The invasion ability of GC cells after downregulating ARMC8

  注：*P＜0.05

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2.4 Wnt/β-catenin信号通路和EMT

用ARMC8 siRNA转染后，HGC-27和AGS细胞中上皮细胞标记物E-cadherin上调，间充质细胞标志物N-cadherin下调。研究还检测了EMT关键转录因子snail的蛋白表达。发现抑制ARMC8表达后，snail的表达受到抑制（图5A）。这些结果进一步说明ARMC8在GC进展中起重要作用，且与EMT过程密切相关。研究表明，EMT的过程不仅受转录因子如slug，snail，ZEB1和twist的调节，还受某些信号通路的控制，包括TGF-β/smad和Wnt/β-catenin等[16-17]。为检测GC细胞中ARMC8调节EMT的机制，通过WB验证ARMC8是否能激活或抑制Wnt/β-catenin途径。结果表明，与NC组相比，下调ARMC8可抑制β-catenin、c-myc、cyclinD1的表达（图5B）。上述结果表明，下调ARMC8可以通过抑制Wnt/β-catenin信号通路来抑制GC细胞的EMT。

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  图5 下调ARMC8后EMT抑制和Wnt/β-catenin信号通路激活情况

  Figure 5.The EMT suppression and activation of Wnt/β-catenin signaling pathway after downregulating ARMC8

  注：A. 用si-ARMC8和NC转染HGC-27和AGS细胞后，WB检测ARMC8、E-cadherin N-cadherin和snail蛋白表达水平；B. WB检测β-catenin、cyclinD1、c-myc蛋白表达水平

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3 讨论

ARMC8是一种新型的犰狳重序列蛋白，研究表明ARMC8是CTLH复合物的关键成分之一，与PI3激酶、Wnt、TGF-β和NF-κB途径的基本生物学过程和功能有关，参与调节增殖、存活、程序性细胞死亡、细胞粘附、迁移和其他活动[18]。越来越多的与ARMC8相关的研究集中于肿瘤的发生发展方向，特别是肿瘤转移。据报道，ARMC8已被发现在许多癌症中表达上调，如非小细胞性肺癌、乳腺癌、卵巢癌、结肠癌、肝癌等[6-9,19]，并与TNM分期、淋巴结转移、预后不良显著相关，乃至被认为是预后标志物或潜在的有效治疗靶点。本研究表明，与正常胃黏膜组织相比，ARMC8在GC组织中表达明显升高，并在GC患者血浆及GC细胞系中检测到ARMC8的高表达水平。然而，ARMC8在GC中的作用和机制尚不明确。

本研究进行了一些细胞功能实验验证ARMC8对GC的影响，结果表明，ARMC8是人GC中的一个促癌基因，其表达与GC细胞的侵袭和迁移能力呈正相关。用si-ARMC8转染GC细胞后，其迁移、侵袭能力都有所抑制。因此，认为ARMC8具有促进GC细胞恶性行为的能力。

有研究表明，ARMC8在癌细胞的EMT中起着重要作用，如 ARMC8的沉默可以抑制骨肉瘤细胞[11]及膀胱癌细胞[12]EMT的发生，而促进皮肤鳞状细胞癌EMT的发生[13]。此外，多项研究表明ARMC8可以通过经典的Wnt信号通路调节癌细胞的EMT[11-13]。典型的Wnt信号通路的一个关键组成部分是β-catenin。Wnt信号通路的激活诱导β-catenin的核易位，这不仅启动了下游基因转录的级联反应，包括cyclinD1，c-myc和MMP，还增加了EMT调节因子snail和vimentin在癌细胞中的表达[20-21]。在膀胱癌[12]及骨肉瘤细胞[11]中，ARMC8沉默抑制癌细胞EMT进展及β-catenin、cyclinD1和c-myc的表达。ARMC8在皮肤鳞状细胞癌中通过抑制Wnt/β-catenin通路和EMT来抑制肿瘤进展[13]。通过ARMC8对GC细胞EMT过程的影响，结果显示抑制ARMC8的表达后，GC细胞中E-cadherin的表达增加，而N-cadherin以及EMT关键转录因子snail则相反。因此，下调ARMC8的表达抑制了GC的EMT过程。此外，本研究还观察到下调ARMC8抑制了GC细胞中β-catenin、cyclinD1和c-myc的表达。因此，认为ARMC8可能通过Wnt/β-catenin信号传导促进了GC细胞的EMT。

综上，ARMC8在GC组织、血浆及细胞系中均表达上调，抑制ARMC8的表达可抑制GC细胞的侵袭和迁移能力，说明ARMC8可通过激活Wnt/β-catenin信号通路调节EMT从而促进GC的恶性进展，基于ARMC8/Wnt/β-catenin轴的生物或药物干预GC的EMT过程可能是一种有潜力的GC治疗新策略。

利益冲突 所有作者均声明不存在利益冲突。

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