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膀胱癌m6A调节因子预后模型建立与分析

发表时间:2024年03月27日阅读:179次 下载:563次 下载 手机版

作者: 白洋洋 1 郭依琳 2 陈瑞廷 1 潘世杰 1 孙继建 1

作者单位: 1. 河南省中医院(河南中医药大学第二附属医院)泌尿外科(郑州 450002) 2. 郑州大学第二附属医院妇科肿瘤临床医学研究中心(郑州 450014)

关键词: 膀胱癌 m6A调节因子 免疫浸润 预后模型

DOI: 10.12173/j.issn.1004-4337.202310110

基金项目: 河南省卫生健康委国家中医临床研究基地科研专项(2022JDZX142)

引用格式: 白洋洋, 郭依琳, 陈瑞廷, 潘世杰, 孙继建. 膀胱癌m6A调节因子预后模型建立与分析[J]. 数理医药学杂志, 2024, 37(3): 180-189. DOI: 10.12173/j.issn.1004-4337.202310110

Bai YY, Guo YL, Chen RT, Pan SJ, Sun JJ. Establishment and analysis of prognostic model of m6A regulators in bladder cancer[J]. Journal of Mathematical Medicine, 2024, 37(3): 180-189. DOI: 10.12173/j.issn.1004-4337.202310110[Article in Chinese]

摘要| Abstract

目的  分析m6A调节因子对膀胱癌(bladder cancer, BC)预后的影响,建立预后预测模型。

方法  从癌症基因组图谱(The Cancer Genome Atlas, TCGA)数据库获取397例BC组织的高通量测序数据和对应的临床病理特征数据。在26个m6A调节因子中,采用单因素Cox回归筛选预后相关的m6A调节因子,利用最小绝对值收敛和选择算子(least absolute shrinkage and selection operator, LASSO)Cox回归分析方法构建BC预后预测模型,比较高低风险组总生存期(overall survival, OS)、免疫检查点相关基因和靶向治疗相关基因表达的差异。通过基因集富集分析比较高低风险组中信号通路的富集情况,采用单样本基因富集分析(single sample gene set enrichment analysis, ssGSEA)和估计恶性肿瘤组织中基质和免疫细胞(estimation of stromal and immune cells in malignant tumors using expression data, ESTIMATE)法评估高低风险组免疫细胞浸润水平的差异。

结果  YTHDC1、IGF2BP3、LRPPRC、FTO和ALKBH3是BC独立的预后因素。利用LASSO Cox回归方法基于5个m6A调节因子建立BC预后预测风险模型,Kaplan-Meier分析结果提示高低风险组间OS存在显著差异(P<0.001),受试者工作特征(receiver operating characteristic, ROC)曲线下面积为0.665。高风险组在趋化因子、NOD样受体、嘌呤代谢、丙酮酸代谢等信号通路富集,具有丰富的免疫细胞浸润特征,PD-L1、CTLA-4、EGFR和KRAS基因表达更高。

结论  本研究基于m6A调节因子构建的BC预后预测模型准确性较好,有助于临床上预后判断和分层个体化治疗。

全文| Full-text

膀胱癌(bladder cancer, BC)是常见的男性泌尿系统恶性肿瘤之一。2020年全球BC新发病例数超过55万,死亡病例数超过20万[1]。在中国,BC发病率位居全部恶性肿瘤的第13位,严重威胁男性的生命健康[2-3]。根据是否侵犯膀胱肌层,BC可分为非肌层浸润性和浸润性。非肌层浸润性BC患者首选经尿道膀胱肿瘤切除术联合膀胱内治疗,术后生活质量较好,但约30%患者存在局部浸润或远处转移可能[4]。对于浸润性BC,约25%患者伴有淋巴结转移,5%出现远处转移,预后较差[5]。近年来,随着免疫治疗的应用,BC患者预后有所改善,但由于肿瘤异质性,并非所有BC患者均能从中获益[6-7]。因此,探究BC发生发展的分子机制对提高BC患者治疗反应率意义重大。

N6-甲基腺嘌呤(N6-methyladenosine, m6A)是在RNA腺嘌呤残基的第6位含氮碱基位置上添加一个甲基基团,是真核生物中最丰富的表观转录组学修饰[8]。研究发现,m6A修饰主要由m6A调节因子,即编码器-甲基转移酶复合物、消码器-去甲基化酶和读码器-m6A读取蛋白调控[9]。有研究指出,m6A调节因子具有免疫调节功能,可影响肿瘤微环境(tumor microenvironment, TME)中免疫细胞浸润,并对免疫治疗疗效产生影响[10]。目前,m6A调节因子对BC预后影响的相关研究较少。本研究利用预后相关的m6A调节因子构建BC预后预测模型,评估TME中免疫细胞浸润情况,进一步预测免疫治疗和靶向治疗的疗效,为BC的临床治疗提供参考。

1 资料与方法

1.1 RNA测序转录组数据和临床数据获取

利用癌症基因组图谱(The Cancer Genome Atlas, TCGA)数据库(https://www.cancer.gov/ccg/research/genome-sequencing/tcga),获取397例BC组织的高通量转录组测序数据和对应的临床病理特征数据。397例BC患者的临床病理特征见表1。

  • 表格1 397例BC患者的临床病理特征
    Table 1.Clinical and pathological characteristics of 397 patients of BC

1.2 预后相关的m6A调节因子筛选

检索中国知网、Pubmed、Embase数据库,中文检索词包括m6A调节因子、m6A修饰,英文检索词包括m6A RNA methylation、m6A regulatory factors。共筛选到26个m6A调节因子,包括9个编码器(WTAP、ZC3H13、RBM15、METTL3、RBM15B、KIAA1429、METTL5、METTL14、METTL16)、14个读码器(LRPPRC、HNRNPA2B1、IGF2BP1、IGF2BP2、IGF2BP3、YTHDF1、YTHDF2、YTHDF3、HNRNPC、FMR1、ELAVL1、YTHDC1、YTHDC2、RBMX)和3个消码器(ALKBH5、FTO、ALKBH3)。通过R软件corrplot包计算26个m6A调节因子之间表达的相关性,利用survival包对26个m6A调节因子进行单因素Cox回归分析,结果通过forestplot包输出,筛选预后相关的m6A调节因子。

1.3 预后预测模型构建及验证

利用最小绝对值选择与收缩算子(least absolute selection and shrinkage operator, LASSO)Cox回归,筛选出5个预后相关m6A调控因子(P<0.05),构建预后预测模型。每例BC患者的风险评分等于5个m6A调控因子中每个基因表达量乘以系数之和(Coefi为风险系数,Xi为基因表达量)。计算公式如下:风险评分=  [11]。分别计算397例BC患者的风险评分,根据中位风险评分分为高风险组和低风险组,比较两组间5年生存差异。绘制受试者工作特征(receiver operating characteristic curve, ROC)曲线并计算ROC曲线下面积(area under ROC curve, AUC),评估所构建预后预测模型的预测价值。利用单因素Cox回归和多因素Cox回归评估预后预测模型和临床病理特征对BC预后的影响。

1.4 基因集富集分析和免疫浸润分析

在上述构建的BC预后预测模型中,通过MSigDB数据库(http://www.broadinstitute.org/gsea/msigdb/index.jsp)获取京都基因与基因组百科全书(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes, KEGG)相关通路基因集,利用R软件GSVA包对高风险组和低风险组进行富集分析,明确两组KEGG相关信号通路。利用聚类分析和单样本基因集富集分析(single sample gene set enrichment analysis, ssGSEA)[12]评估高风险组和低风险组中23种免疫细胞类型的频率差异,并计算免疫细胞的相对浸润丰度。利用估计恶性肿瘤组织中基质和免疫细胞(estimation of stromal and immune cells in malignant tumors using expression data, ESTIMATE)方法评估高风险组和低风险组中每个样本中免疫、基质成分及两者之和在TME中的比例,即Immune分数、Stromal分数和Estinate分数。

1.5 基因相关性分析

利用R软件limma包,比较高风险组和低风险组在免疫检查点相关基因PD-L1和CTLA- 4[13]、靶向治疗相关基因HER-2[14]、BRAF[15]、KRAS[16]和EGFR[17]的表达差异,绘制箱式图,以P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 预后相关m6A调节因子筛选

本研究纳入397例BC组织样本。利用R软件分析26个m6A调节因子在BC中表达水平之间的相关性,结果显示除IGF2BP2与YTHDC1、IGF2BP2与METTL3,以及ALKBH3与FMR1外,大部分m6A调节因子之间的表达存在显著正相关性,其中HNRNPC与HNRNPA2B1的正相关性最强(r=0.66),见图1-A、图1-B。为进一步筛选与BC预后相关的m6A调节因子,参考Feng等[18]的研究,通过单变量Cox回归发现YTHDC1、IGF2BP3、LRPPRC、FTO和ALKBH3是BC独立的预后因素,其中IGF2BP3、LRPPRC、FTO和ALKBH3为危险调节因子,其高表达与较差的预后有关,而YTHDC1为保护调节因子,其高表达与较好的预后有关,见图2。

  • 图1 BC中m6A调节因子表达相关性
    Figure 1.Correlation of m6A regulator expression in BC
    注:A. 26个m6A调节因子表达的相关性热图;B. 26个m6A调节因子表达的相关性圈图。

  • 图2 BC中m6A调节因子单因素Cox回归分析
    Figure 2.Univariate Cox regression analysis of m6A regulators in BC

2.2 构建BC预后预测模型

利用上述筛选的YTHDC1、IGF2BP3、LRPPRC、FTO和ALKBH3,通过LASSO Cox回归方法建立BC预后预测模型,见图3-A。在模型中,YTHDC1、IGF2BP3、LRPPRC、FTO和ALKBH3的系数分别为-0.08、0.12、0.03、0.19和0.03。根据模型计算每例BC患者的风险评分,将患者分为高风险组和低风险组。低风险组的OS显著高于高风险组(P<0.001),见图3-B。利用ROC曲线分析预后模型预测BC患者5年生存率的准确性,结果显示AUC值为0.665。

  • 图3 基于m6A调节因子构建BC风险预后模型
    Figure 3.Prognostic risk model of BC based on m6A regulators
    注:A. LASSO Cox回归模型构建预后预测模型;B. 高风险组和低风险组生存分析。

2.3 预后预测模型的临床价值

绘制YTHDC1、IGF2BP3、LRPPRC、FTO和ALKBH3在高风险组和低风险组中的表达量及与临床特征的热图,结果显示其表达量在临床分期中的差异有统计学意义,见图4。单因素Cox回归和多因素Cox回归分析结果显示,年龄、临床分期和风险评分与OS相关(P<0.001),均为BC独立的预后影响因素,见表2。

  • 图4 基于5个m6A调节因子构建的预后模型与临床特征的关系热图
    Figure 4.Heatmap of the relationship between prognostic model based on five m6A regulators and clinical characteristics
    注:***P<0.001,**P<0.01。

  • 表格2 BC预后预测模型与临床特征的关系
    Table 2.Relationship between BC prognostic prediction model and clinical characteristics

2.4 基因集富集分析

基因集富集分析结果显示,高风险组在趋化因子、NOD样受体、嘌呤代谢、丙酮酸代谢等信号通路富集,而低风险组在药物代谢细胞色素P450、亚油酸代谢、α-亚麻酸代谢等信号通路富集,见图5。

  • 图5 BC预后预测模型的功能富集分析
    Figure 5.Functional enrichment analysis of prognostic risk model in BC

2.5 免疫浸润分析

采用ssGSEA评估高风险组和低风险组中23种免疫细胞类型的频率差异,结果发现高风险组免疫细胞浸润程度显著高于低风险组,特别是激活的CD4+T细胞、激活的CD8+T细胞、激活的B细胞、嗜酸性粒细胞、激活的树突细胞、Th1细胞、Th17细胞、中性粒细胞等,提示高风险组和低风险组具有不同的免疫细胞浸润特征,见图6-A。ESTIMATE计算高风险组和低风险组中每个样本中免疫、基质成分及两者之和在TME中的比例,发现高风险组Immune分数、Stromal分数和Estinate分数均高于低风险组,见图6-B。上述结果表明高风险组的TME为免疫炎症型,具有丰富的免疫细胞浸润。

  • 图6 BC预后预测模型的免疫浸润分析
    Figure 6.Immune infiltration analysis of prognostic risk model in BC
    注:A. ssGSEA分析;B. ESTIMATE分析;***P<0.001。

2.6 基因相关性分析

进一步分析免疫检查点相关基因PD-L1和CTLA-4、靶向治疗相关基因HER-2、BRAF、KRAS和EGFR在高风险组和低风险组之间的表达差异,结果发现PD-L1、CTLA-4、EGFR和KRAS在高风险组中表达更高,HER-2和BRAF在低风险组表达更高,差异均有统计学意义(P<0.05),见图7。以上结果提示高风险组可能对PD-L1抑制剂、CTLA-4抑制剂、EGFR抑制剂和KRAS抑制剂更敏感,而低风险组可能对HER2抗体和BRAF抑制剂更敏感。

  • 图7 高低风险组间免疫检查点相关基因和靶向治疗相关基因表达差异
    Figure 7.Differences in the expression of immune checkpoint related genes and targeted therapy related genes between high and low risk group
    注:A. PD-L1基因;B. CTLA-4基因;C. KRAS基因;D. EGFR基因;E. HER-2基因;F. BRAF基因。

3 讨论

BC是一种来源于膀胱黏膜的恶性肿瘤。手术和放化疗是其主要的治疗方式,然而即使接受标准治疗,仍有50%~70%患者出现复发或转移,晚期和转移性BC的治疗效果不理想[5]。目前BC仍缺乏特异性预后标志物,因此,探究新型预后预测标志物并建立预后预测模型对治疗BC具有重要的临床价值。

m6A调节因子的异常表达可能影响肿瘤的发生发展[9]。随着m6A修饰研究领域的不断突破,越来越多的新m6A调节因子被发现。本研究分析了26个m6A调控因子表达的相关性,发现BC中m6A调节因子之间的表达存在显著相关性。进一步筛选与BC预后相关的m6A调节因子,单变量Cox回归结果显示YTHDC1、IGF2BP3、LRPPRC、FTO和ALKBH3是BC独立的预后因素。IGF2BP3和IGF2BP1同属IGF2BP家族,是m6A阅读蛋白的一种。有研究证实IGF2BP3在BC组织内的高表达,可通过调节HMGB1信号通路促进BC的发展,进而影响BC患者预后 [19]。周子健等通过临床标本验证了BC组织内IGF2BP1的高表达可提示BC患者预后不良,转染IGF2BP1 siRNA后BC细胞的增殖和生长被显著抑制[20]。脂肪量和肥胖相关蛋白FTO在多种癌症组织中表达,刺激肿瘤细胞代谢,诱导肿瘤细胞浸润和进展。苏甲林通过检测24例BC组织及癌旁正常组织FTO的表达,发现与对应癌旁组织相比,BC组织中FTO相对低表达,且与病理分期分级呈负相关[21]。

近年来,有研究利用m6A调节因子建立头颈鳞癌[22]、肝癌[23]、结直肠癌[24]的预后预测模型,并验证发现其具有较好的预测价值,可以指导后续临床治疗。Wu等分析了23个m6A调节因子与临床病理特征和预后的相关性,提示m6A调节因子可以作为BC预后评估的潜在分子靶点[25]。Chen等分析了13个m6A调节因子在BC中的表达情况,并选择FTO、YTHDC1和WTAP构建预后预测模型[26]。Zheng等利用FTO和YTHDF2评估BC预后预测模型的应用价值[27]。本研究纳入了更多m6A调控因子,更全面地探讨了m6A修饰对BC预后预测的价值。通过Cox回归模型选择5个m6A调节因子(YTHDC1、IGF2BP3、FTO、ALKBH3和LRPPRC)建立BC预后预测模型,ROC曲线检测风险评分预测BC患者5年生存率的准确性,结果显示AUC值为0.665。本研究与Zheng等[27]建立的模型(5年AUC=0.614)相比,5年AUC值更高,进一步分析发现Zheng等[27]利用单因素Cox筛选预后相关m6A调节因子时设置筛选标准为P<0.15,最后纳入预后模型构建的YTHDF2(P=0.112)对BC患者预后的影响较小,本研究将筛选标准设置为P<0.05,以确保参与模型构建的每个m6A调节因子都与BC预后相关。另外,按照风险评分将BC患者分为高风险组和低风险组,经过单因素Cox回归及多因素Cox回归发现年龄、临床分期和风险评分与OS相关,是BC独立的预后影响因素。

m6A调节因子具有免疫调节功能,可影响TME中免疫细胞浸润,并对免疫治疗疗效产生影响[10]。利用ssGSEA和ESTIMATE法比较高风险组和低风险组中免疫细胞浸润水平的差异,结果发现,两组具有不同的免疫细胞浸润特征,高风险组具有丰富的免疫细胞浸润,其TME为免疫炎症型,即热肿瘤对免疫治疗疗效更好[28]。

靶向治疗和免疫治疗的快速发展极大程度提高了BC患者的OS,并改善了其预后。但由于肿瘤异质性,并非所有的BC患者均能从靶向治疗和免疫治疗中获益。为了探讨建立的预后预测模型对靶向治疗和免疫治疗的指导作用,本研究选择了免疫检查点相关基因PD-L1和CTLA- 4、靶向治疗相关基因HER-2、BRAF、KRAS和EGFR,比较高风险组和低风险组中这些基因表达的差异,结果发现PD-L1、CTLA-4、EGFR和KRAS在高风险组中表达更高,HER-2和BRAF在低风险组中表达更高,提示高风险组可能对PD-L1抑制剂、CTLA-4抑制剂、EGFR抑制剂和KRAS抑制剂更敏感,而低风险组可能对HER2抗体和BRAF抑制剂更敏感,间接预测了高低风险组患者对免疫治疗和靶向治疗的疗效差异。本研究存在一定局限性,仅分析了TCGA数据库,未进行临床试验验证。

综上所述,本研究利用5个m6A调节因子在BC中构建预后预测模型并验证其临床应用价值,评估预后预测模型中免疫细胞浸润程度,该模型可能成为评估BC患者是否适合免疫治疗和靶向治疗的参考指标,为临床医师的治疗选择提供依据。

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