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目的 通过孟德尔随机化分析探索慢性阻塞性肺疾病（chronic obstructive pulmonary disease，COPD）和肠道菌群的关系。
方法 将肠道菌群作为暴露因素，COPD作为结局因素，以单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphisms，SNPs）作为工具变量，采用孟德尔随机化分析探讨肠道菌群与COPD的关系。
结果 识别了13种COPD相关的细菌，研究结果发现毛螺菌（P=0.023）、梭状芽孢杆菌（P=0.039）和阿克曼菌（P=0.047）与COPD的相关性最为显著。白介素4（interleukin-4，IL-4）为关联细菌种类最多的炎症因子，通过中介分析发现，IL-4在三种细菌（梭状芽孢杆菌、肠杆菌和瘤胃球菌）与COPD之间存在中介效应。
结论 肠道菌群对COPD的气道炎症反应和肺功能等方面具有影响,如吸烟或哮喘的人群毛螺菌丰度会大量减少，瘤胃球菌和细胞炎症因子水平具有明显相关性。
慢性阻塞性肺疾病（chronic obstructive pulmonary disease，COPD）是临床常见的一种呼吸道疾病，具有较高的患病率和致残率，严重危害人类健康[1]。COPD是一种异质性疾病，致病机制较为复杂。尽管吸烟被认为是较为重要的危险因素，但仅有不到四分之一的吸烟者最终发展为COPD[2]。研究发现，COPD患者存在肠道菌群失调的情况，其肠道菌群的组成、丰度及多样性与健康人群存在明显差异[3]。炎症因子是加重COPD肺部慢性损伤的因素，已有研究发现双歧杆菌等与肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白介素6（interleukin-6，IL-6）和白介素8（interleukin-8，IL-8）呈负相关关系，可以抑制肺部炎症[1, 4]。
肠道菌群丰度主要通过采用16srRNA测序和宏基因组测序获得。16srRNA测序速度快，价格适中，能够提供物种水平信息，适用于快速了解肠道菌群状态，但是不能提供深层次的研究。宏基因组测序虽然能够深入获取菌群组成、功能富集及菌株水平信息，但耗时长且价格昂贵。由于大量样本检测需要高投入的经费，因此，国内很多研究机构均无法获得大量样本的肠道菌群数据，特别是COPD方面的研究更少。随着最新的国际肠道微生物菌群的全基因组关联研究（Genome-Wide Association Studies，GWAS）汇总数据公开，利用一些因果推断方法可以在没有原始肠道菌群测序数据的情况下获得细菌与疾病的关联。作为因果推断的方法之一，孟德尔随机化（Mendelian randomization，MR）利用单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphisms，SNPs）作为工具变量（instrumental variables，IVs），在消除混杂因素的影响下推断暴露与结局之间的因果关联[5]。本研究将肠道菌群作为暴露因素，以COPD和炎症因子作为结局因素，以SNPs作为IVs，采用MR以及中介分析探讨肠道菌群与COPD和炎症因子的关系。
1 资料与方法
1.1 数据来源
肠道微生物菌群的GWAS汇总数据来自包含25个队列及11个国家的大规模多种族全基因组关联研究[6]（https://mibiogen.gcc.rug.nl）。通过靶向16S rRNA基因的三个不同的可变区域（V4、V3-V4和V1-V2）来描述微生物的构成。肠道菌群的细菌分类依次为门、纲、目、科、属、种（亚种）。门和种分别是细菌分类中最大和最小的层面，即门包含的细菌类别最少，而种包含的细菌类别最多。本研究选择了属水平上的131种菌群进行分析，其中12种菌群未通过微生物菌群鉴定，予以排除，最终共有119种属水平的菌群进入MR分析。
1.2 IVs选取
基于孟德尔遗传学定律，亲代的等位基因会随机分配给子代，那么基因与结局的关系不会受到出生后环境、社会经济、行为习惯等常见混杂因素的干扰[7]。因此，在以SNPs作为IVs的MR分析中，利用自然的遗传变异来模拟随机化实验，从而推断疾病与性状之间的因果关系。本研究中，对于肠道菌群的GWAS数据，以P＜5×10-8作为SNPs的筛选标准，通过连锁不平衡分析确保SNPs的独立性。计算F值并排除弱IVs，F＜10的SNPs被认为是弱IVs而被排除[8]。
1.3 MR分析
MR分析法需要满足3个假设条件[9]：①IVs与暴露因素之间具有较强的关联性；②IVs与结局不存在直接关联，即不存在基因多效性；③IVs与混杂因素相互独立。MR分析的常用方法包括逆方差加权法（inverse variance weighted，IVW）、加权中位数法（weighted median，WME）、MR-Egger法、简单模式法（simple mode，SM）和加权模式法（weighted mode，WM）。其中，IVW是MR分析的常用方法，该方法通过结合每个SNPs因果效应的Wald比值来估计因果效应[10]。由于数据库中COPD GWAS相关的研究较少，为进行探索性分析且避免损失潜在的阳性结果，本研究对于所有方法获得的相关系数，按照P＜0.1的标准确定菌群与COPD和炎症因子的相关性。
1.4 敏感性分析及中介分析
采用异质性检验、水平多效性检验和共定位分析进行敏感性分析。异质性检验采用Cochrane's Q法，P＜0.05表示存在异质性[11]。水平多效性检验采用Egger回归法，若P＞0.05，表明IVs不存在水平多效性。共定位分析是将关联多种性状的SNPs筛选出来，从而剔除可能具有多效性的SNPs。共定位分析设置以下5个假设：H0. 所选基因组区域的SNPs与菌群和COPD均无关；H1. 所选基因组区域有SNPs与COPD有关，与菌群无关；H2. 所选基因组区域有SNPs与菌群有关，与COPD无关；H3. 所选基因组区域有SNPs与COPD和菌群有关，但由不同的因果变异位点驱动；H4. 所选基因组区域有SNPs与COPD和菌群都有关，且共享同一个因果变异位点。通过贝叶斯方法计算五种假设的后验概率（PP.H0-PP.H4），五种假设的后验概率和为1，当按照某个假设计算的后验概率越高，说明该假设更可能成立。本研究中，PP.H4 ＞0.7的SNPs被认为是具有多效性的IVs。此外，本研究还应用中介分析探讨肠道菌群、炎症因子和COPD之间的关系。全部分析采用R软件（http://www.r-project.org）的TwoSampleMR和RMediation软件包执行，研究流程见图1，其中，A*B为间接效应（中介效应），总效应C=直接效应C’+间接效应A*B，中介效应比=|间接效应（中介效应）/总效应|。
2 结果
2.1 COPD相关的菌群
以119种属水平上的肠道菌群作为暴露变量，COPD为结局变量（研究编号：ukb-b-20464）进行MR分析。以P＜0.1为标准，采用5种MR方法识别了13种与COPD相关的细菌，见表1，其中毛螺菌（P=0.023）、梭状芽孢杆菌（P=0.039）和阿克曼菌（P=0.047）与COPD的相关最为显著。图2为毛螺菌和梭状芽孢杆菌的线性回归图。
2.2 敏感性分析
对识别的13种细菌进行敏感性分析，在异质性检验中，IVW方法显示P值的范围为0.081~0.894，MR-Egger方法显示P值的范围为0.083~0.982，说明研究不存在异质性。在水平多效性检验中，P值的范围在0.091~0.962，均大于0.05，表明IVs不存在水平多效性，见表2。此外，对13种细菌的留一法（leave-one-out）检验结果证实去除任意一个SNPs均不会对回归系数产生较大的影响，说明MR分析结果是稳健的，留一法结果见图3，图中红色圆点表示采用留一法后获得每种细菌与糖尿病关联的回归系数平均值，黑色横线表示回归系数的范围。通过对13种COPD相关的细菌进行共定位分析，结果发现，所有的SNPs（对应13种细菌）的PP.H4均小于0.4，因此可以认为这些SNPs作为IVs，不是由同一个因果变异位点驱动，因此不存在基因多效性，结果见表3。
2.3 炎症因子相关的细菌和中介分析
以13种COPD相关的菌群作为暴露变量，分别以炎症因子白介素-4（interleukin-4，IL-4，研究编号：prot-c-2906_55_3）、IL-6（研究编号：prot-c-4673_13_2）、IL-8（研究编号：prot-c-3447_64_2）和白介素-17（interleukin-17，IL-17，prot-c-3498_53_2）作为结局变量，以P ＜0.1为标准，分析13 种COPD相关的细菌和炎症因子的关系。文中仅展示IVW的结果，结果显示，阿克曼菌与IL-17呈负相关关系（b=-0.741，P=0.039）；梭状芽孢杆菌与IL-4呈正相关关系（b=0.965，P=0.051），肠杆菌和瘤胃球菌均与IL-4呈负相关关系（b=-0.439，P=0.074；b=-0.804，P=0.092）；瘤胃球菌与IL-6呈负相关关系（b=-1.047，P=0.003），腹足真杆菌与IL-6呈正相关关系（b=0.559，P=0.079）；腹足真杆菌与IL-8呈负相关关系（b=-0.888，P=0.004），考拉杆菌与IL-8呈正相关关系（b=0.953，P=0.055），见图4。
依据上文的研究结果，关联细菌种类最多的炎症因子为IL-4（关联三种细菌：梭状芽孢杆菌、肠杆菌和瘤胃球菌），以IL-4作为中介，采用中介分析探讨这三种细菌与IL-4和COPD之间的关系，结果见表4。按照P＜0.1的标准，结果显示对于这三种细菌与COPD之间的关联，IL-4均存在中介效应。
3 讨论
本研究以SNPs作为IVs，采用MR分析探讨了肠道菌群与COPD的关联，发现13种细菌与COPD关联，其中毛螺菌、梭状芽孢杆菌和阿克曼菌与COPD的相关性最为显著，且链球菌在COPD人群中有较高的丰度。Bowerman等研究发现，COPD患者肠道中的链球菌水平较正常人高[3]。有研究已证实链球菌和毛螺菌科的多重细菌与肺功能减退密切相关[12]。研究还发现，梭状芽孢杆菌在COPD人群中丰度较高[13]。COPD与吸烟具有相关性，而吸烟会导致梭状芽孢杆菌的水平升高，在患者戒烟后梭状芽孢杆菌的丰度会降低[14]。此外，吸烟会导致肠道微生物构成发生显著变化，如吸烟者链球菌的丰度增加，而厚壁菌门的丰度，特别是毛螺菌属的丰度会大幅降低[15]。本研究显示，阿克曼菌与COPD相关联。一项研究通过香烟烟雾暴露和连续感染甲型H1N1流感病毒和不可分型流感嗜血杆菌（NTHi）建立急性加重期COPD的小鼠模型，发现H1N1和NTHi共同感染增加了细胞因子和粘附分子及免疫细胞的水平，并导致肠道细菌多样性下降，其中阿克曼菌和毛螺菌与细胞因子水平呈负相关关系[16]。此外，病毒和细菌感染是COPD加重的诱因，研究显示，合并肺部感染的COPD患者血清中的IL-4、IL-6和IL-8水平显著增加，提示炎症反应加重，这些感染也会导致肠道菌群失调[17]。在COPD急性加重期，患者血清中的沉默信息调控因子SIRT1与IL-6等炎症因子具有相关性[18]。本研究还发现瘤胃球菌、腹足真杆菌与炎症因子IL-6相关。IL-6主要由巨噬细胞、T细胞、B细胞和血管内皮细胞等多种细胞产生，其水平可反映患者的病情变化。有研究报道，IL-6水平在COPD患者中显著升高，且与肺功能下降有关[19]。COPD是由慢性气道炎症导致，有动物实验研究发现小鼠肠道瘤胃球菌的丰度与气道炎症相关[20]。因此，瘤胃球菌的丰度对气道性疾病的发生发展可能产生潜在影响，这些影响有待进一步的生物学机制研究阐明。
通过中介分析发现，在梭状芽孢杆菌、肠杆菌和瘤胃球菌与COPD的关联中，IL-4存在中介效应。研究发现，IL-4的下游效应细胞能够影响嗜酸性粒细胞的成熟和募集，还能够发挥更全面的抗炎作用以减轻肺部炎症和肺功能下降[21]。而最近的研究又发现肠杆菌的丰度与IL-4水平也具有相关性[22]。因此，肠杆菌的丰度影响了IL-4水平，而IL-4水平对气道性疾病的炎症和肺功能均有潜在影响，但其生物机制有待进一步的研究。
本研究通过MR分析和中介分析发现了13 种与COPD存在潜在关联的细菌，且IL-4在三种细菌（梭状芽孢杆菌、肠杆菌和瘤胃球菌）与COPD之间存在中介效应。本研究存在一定局限性，由于GWAS汇总数据库中COPD相关的研究较少，为进行探索性分析，将显著性阈值扩大为0.1，可能产生假阳性结果；此外，计算得出的中介效应比也相对较低。随着COPD GWAS研究的增加，未来将进行持续的分析并对本研究结果进一步验证，通过COPD相关的肠道菌群和代谢组学的大数据分析及生物实验进行更深入的机制研究。
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