目的  通过深入挖掘基因表达综合（Gene Expression Omnibus，GEO）数据库，筛选潜在调控代谢功能障碍相关脂肪性肝炎（metabolic dysfunction-associated steatohepatitis，MASH）的关键基因，利用体内外模型对其功能进行研究，初步揭示其潜在调控机制。

方法  整合GEO数据库中鼠类 [胆碱缺乏饲料（choline deficient diet，CD）组 vs. 高脂肪/高胆固醇饮食（high-fat/high-cholesterol diet，HFHC）组；CD组 vs. 蛋氨酸、胆碱联合缺乏饲料（methionine-  and choline deficient diet，MCD）组]及人类（健康 vs. MASH）对比组的转录组数据，筛选差异表达基因并进行富集分析。构建体外MASH模型 [棕榈酸（palmitic acid，PA）/油酸（oleic acid，OA）联合刺激小鼠原代肝细胞]和体内模型（腺相关病毒介导肝细胞特异性基因敲除的Cas9转基因小鼠，HFHC喂养16周）。通过定量逆转录聚合酶链式反应（quantitative reverse transcription-polymerase chain reaction，qRT-PCR）、蛋白免疫印迹（Western blot，WB）验证候选基因表达，采用尼罗红染色、脂质检测（甘油三酯）评估脂质积累。通过体内实验检测血清指标，包括低密度脂蛋白胆固醇（low-density lipoprotein cholesterol，LDL-C）、天冬氨酸氨基转移酶（aspartate transaminase，AST）、丙氨酸氨基转移酶（alanine transaminase，ALT）、乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase，LDH），采用苏木精-伊红染色法（hematoxylin- eosin staining，HE）、天狼星红染色（picrosirius red，PSR）、油红O（oil red O，ORO）染色、免疫组织化学染色（immunohistochemistry，IHC）等组织染色方法评估肝脏病理改变。通过转录组测序（RNA sequencing，RNA-seq）分析代谢通路。

结果  共筛选出16个共同差异基因（Ubd、ANAX2、TREM2、LGALS3、CAPG、LPL、CCL2、TOP2A、CD52、EMP3、MKI67、TMSB10、CCDC88A、S100A4、CRIP1、TAGLN2），其中Ubd的表达量最高。在临床MASH患者及小鼠MASH模型中，Ubd基因的mRNA表达水平显著上调（P＜0.05）。小鼠原代肝细胞内过表达Ubd会加重PA/OA刺激诱导的脂质堆积，而敲低Ubd能够减轻PA/OA诱导的脂质堆积。在小鼠体内MASH模型中，与对照组相比，敲除Ubd组肝脏组织能使脂质堆积明显改善，肝脏ORO染色显著减少，肝脏组织CD11b+炎症细胞显著降低，PSR染色阳性区域显著减少。基于转录组学的机制分析表明，Ubd敲低后会导致脂肪酸代谢途径显著激活，从而有效降低MASH相关脂质堆积及脂毒性。

结论  UBD分子对MASH具有显著影响，其可能通过抑制脂肪酸分解加重脂质堆积，从而加剧MASH疾病的进程。

代谢功能障碍相关脂肪性肝炎（metabolic dysfunction-associated steatohepatitis，MASH）作为代谢功能障碍相关脂肪性肝病（metabolic dysfunction-associated steatotic liver disease，MASLD）的严重形式，主要特征为肝脏脂肪积累、炎症和肝细胞损伤[1]。流行病学研究显示，MASLD发病率在全球范围内正逐年上升，影响了全球25%~30%的人口，已成为全球最常见的慢性肝脏疾病，并在20%的MASLD患者中观察到了MASH[2-4]。在肝脏疾病中，MASH进展为肝硬化、肝衰竭和肝癌的风险更高[5-6]。2024年3月，美国食品药品监督管理局（Food and Drug Administration，FDA）批准了首款针对MASH的甲状腺激素受体β选择性激动剂Resmetirom，其通过调节肝脏脂质代谢及炎症反应改善纤维化进程[7]。目前针对临床MASH可供选择的药物仍有限，因此，针对其发病机制进行深入研究将有助于为该疾病提供新的治疗策略。

目前研究认为，脂肪酸代谢失衡是MASH发展的重要原因，其病理过程涉及脂肪酸的异常累积与代谢紊乱，过量的膳食甘油三酯（triglyceride，TG）摄入或外周脂肪组织过度分解（如胰岛素抵抗状态下），导致肝脏游离脂肪酸（nonestesterified fatty acid，FFA）输入增加 [8- 9]。在胰岛素抵抗或高碳水化合物摄入下，肝脏SREBP-1c/ChREBP通路激活，促进乙酰辅酶A羧化酶（acetyl coA carboxylase，ACC）和脂肪酸合酶（fatty acid synthase，FASN）表达，加速脂质从头合成（de novo lipogenesis，DNL），进一步加剧肝内脂质沉积[10]。肝细胞中FFA的异常堆积会引发多重损伤[11]。FFA衍生的神经酰胺、二酰甘油等毒性脂质激活蛋白激酶C和NF-κB通路，触发肝细胞凋亡、炎症因子释放及星状细胞活化，推动肝炎-纤维化级联反应[12]。尽管FFA可通过肉碱棕榈酰转移酶1（carnitine palmitoyltransferase 1，CPT1）介导的线粒体β-氧化分解供能，但丙二酰辅酶A（ACC产物）对CPT1的反馈抑制及过氧化物酶体氧化途径的活性氧（reactive oxygen species，ROS）生成会加剧代谢压力[13]；TG合成相关酶（如甘油-3-磷酸酰基转移酶、二酰甘油酰基转移酶）表达失调，导致脂滴动态平衡破坏，未酯化的FFA比例升高，放大脂毒性[14-15]。靶向脂肪酸代谢治疗策略包括增强脂肪酸的氧化，如激活过氧化物酶体增殖物激活受体α（peroxisome proliferators-activated receptor α，PPARα），可上调CPT-1的表达，促进FAA在线粒体的氧化，减少脂毒性，还可以抑制脂质新生，靶向ACC或FASN减少DNL，降低肝细胞内FAA的负荷[16-17]。阻断脂毒性信号可有效改善炎症和纤维化，从而缓解MASH的进展 [18- 20]。因此，探究脂肪酸氧化分解的调控机制有望为MASH治疗提供新的靶点。

泛素D（ubiquitin D，UBD）分子是泛素化修饰因子中的一种[21]，既往研究揭示了UBD分子具有多重作用机制[22]。作为类泛素分子，UBD可通过共价修饰靶蛋白，并介导这些蛋白质经蛋白酶体途径降解 [23]。UBD还可通过不依赖于经典修饰功能的方式发挥作用，参与调控机体重要的生理及病理功能。具体而言，UBD能够与关键靶蛋白（如p53、NF-kB等）以非共价结合的形式形成复合物，改变构象，影响其稳定性或活性[24]。UBD还可通过非共价结合自噬相关蛋白（microtubule-associated protein 1 light chain 3，LC3）来调控自噬-溶酶体途径[25]。另外，UBD可以通过与组蛋白修饰酶（如组蛋白去乙酰化酶）相互作用，影响染色质重塑和基因转录结合，在肿瘤发生、免疫逃逸和细胞应激中发挥重要的病理生理作用 [26]。然而，尽管UBD的多种功能已被广泛研究，但肝细胞中UBD在MASH中具体的作用及机制尚未完全明确。本研究基于基因表达综合（Gene Expression Omnibus，GEO）数据库分析挖掘潜在调控MASH的关键基因Ubd，进一步构建体内外模型，探究肝细胞内UBD在MASH中的功能及其机制，以期为制定MASH的新型治疗策略提供新思路。

1 资料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物

实验所用动物均来自湖北贝恩特生物科技有限公司，在无特定病原体（specific pathogen free，SPF）环境下饲养，自由饮水进食，原代肝细胞取自6周龄雄性野生型C57BL/6J小鼠。用于造模的小鼠均为6~8周龄、20~26 g的雄性野生型C57BL/6J小鼠。所有动物实验均是双盲进行，本研究已获得赣南创新与转化医学研究院实验动物伦理委员会批准（GIMI-K2024082）。

1.1.2 实验试剂

胎牛血清（美国Gibco公司，货号A5256701）、DMEM高糖培养基（美国Gibco公司，货号12491015）、青霉素-链霉素（美国Gibco公司，货号15070063）、IV型胶原酶（美国Gibco公司，货号17104019）、HiScript III逆转录试剂盒（中国南京Vazyme公司，货号R333-01）、BCA蛋白定量试剂盒（美国Thermo Fisher公司，货号23227）、ECL化学发光显影剂（Bio-Rad公司，货号1705061）、TRIzol试剂（美国Sigma公司，货号T9424）、戊巴比妥钠（美国Sigma公司，货号A0650000）、蛋白Marker（美国Thermo Fisher公司，货号26616）、三氯甲烷（国药集团，货号10006818）、二甲苯（国药集团，货号10023418）、尼罗红染料（美国Sigma公司，货号19123）、脱脂奶粉（北京索莱宝，货号LP0033B）、DEPC水（上海生工，货号B501005）、一抗稀释液（上海碧云天，货号P0023A）、天狼星红染液（北京索莱宝，货号S8060）、苏木素染液（武汉谷歌生物，货号E607317）、伊红染液（珠海贝索生物，货号BA4025）、棕榈酸（美国Sigma公司，货号P0500）、油酸（美国Sigma公司，货号05508）、油红O染液（美国Sigma公司，货号09755）、PVDF膜（美国Millipore公司，IPFL00010）、琼脂糖（武汉擎科生物，货号TSJ001）、鼠尾胶原蛋白I型（北京索莱宝C8062）、RIPA裂解液（上海碧云天，货号P0013B）、三乙醇胺缓冲盐水溶液（TBS）（国药集团，货号XW120842961）、三羟甲基氨基甲烷（Tris-Bas）（上海翌圣生物，货号60105ES25）、Krebs-Ringer缓冲液（武汉普诺赛，货号PB180347）、乙二胺四乙酸（EDTA）（中国医药集团，货号10009617）、Hanks平衡盐溶液（美国Gibco公司，货号14025092）。

1.1.3 抗体

兔抗-β-actin、兔抗anti-HA、兔抗-Flag均购自美国Sigma公司，货号分别为A5316、H6908、F7425；兔抗-CD11b购自武汉博士德生物，货号为BM3925。

1.1.4 质粒及病毒

病毒入门质粒、腺病毒载体质粒、pHAGE载体购自Addgene公司，货号为ZT1665。腺相关病毒包装由武汉擎科公司提供。

1.1.5 细胞系

HEK293T、HEK293A购自中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库，目录号分别为SCSP-5209、GNHu48。

1.2 实验方法

1.2.1 利用数据库挖掘代谢功能障碍相关脂肪性肝炎相关基因

从GEO数据库（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/）获取与MASH相关的小鼠和人类肝组织转录组数据集共17个对比组的GSE数据。筛选标准：符合（Normal vs. MASH）的GSE，采用R 4.3.3软件中的limma包或DESeq2包进行差异分析。差异分析的数据集包括GSE51432、GSE53381、GSE93132、GSE126848-FALD、GSE109345-24W、GSE35961、GSE126848-MASH、GSE194346、GSE195483、GSE109345-18W、GSE137449、GSE162276、GSE156918、GSE119340、GSE207856-8W、GSE120977、GSE207856-16W。使用R 4.3.3软件的DESeq2包进行差异分析得到差异表达谱。从列名中提取样本条件信息，并将其转换为因子类型。使用DESeqDataSetFromMatrix函数创建DESeqDataSet对象，其中countData为计数矩阵，colData为包含样本条件信息的数据框，design=~condition 表示使用样本条件作为差异分析的因子。利用DESeq函数对DESeqDataSet对象进行差异表达分析，从DESeqDataSet对象中提取标准化后的数据。使用芯片GSE35961、GSE53381、GSE51432的值，通过R 4.3.3软件的oligo包对原始芯片数据进行标准化处理，再使用t检验进行组间的显著性检验，计算P值，采用均值之差计算两组（Normal  vs. MASH）的差异倍数。通过upset()函数对17个数据集中1.5倍的差异上调且P值符合条件的基因进行交集。交集基因筛选标准：表达谱P校正值（P_adj）＜0.05；芯片P＜0.05，log2FC＞log2（1.5）。在17个数据集的差异表达谱中筛选出显著表达的差异基因及其差异倍数[log2（Fold Change）]。计算出它们在17个数据集中的平均差异倍数，按照降序进行排列，得到这些共同的差异基因在17个数据集中的平均差异倍数情况，使用R 4.3.3软件中pheatmap包绘制热图。在17个GSE的表达谱中筛选出这些基因的平均差异倍数值，再绘制柱状图，使用FC列的值作为文本标签，GSE名字居中显示在柱子的底部并去除一些不必要的背景和网格线。

1.2.2 小鼠原代肝细胞分离培养

选用6周龄C57BL/6J雄性野生型小鼠（体重20±2 g），经腹腔切开术后建立原位灌注系统。具体操作如下：经下腔静脉留置22G导管（BD Biosciences），连接恒温（37 ℃）蠕动泵（Harvard Apparatus）进行梯度灌注。首先以Krebs-Ringer缓冲液（含0.5 mM 乙二胺四乙酸）进行门静脉灌注（流速5 mL/min，持续10  min），待肝脏血液充分清除后，换用含0.1% IV型胶原酶的Hanks平衡盐溶液进行消化灌注（流速3  mL/ min，持续15  min）。当观察到肝脏包膜破裂、组织质地明显软化时，完整摘除肝脏并转移至含10%胎牛血清的DMEM高糖培养基中。依次经过100  μm和70 μm细胞筛网双重过滤获得单细胞悬液。通过梯度离心（50×g，4 ℃，3  min×2 次去除非实质细胞及细胞碎片，最终用含1%青霉素-链霉素的完全DMEM培养基调整细胞密度至1×10⁶  cells/ mL，接种于IV型胶原包被的培养皿，置于37 ℃、5% CO₂恒温培养箱（Thermo Scientific）中进行原代培养。

1.2.3 体外棕榈酸/油酸处理造模

为研究棕榈酸（palmitic acid，PA）/油酸（oleic acid，OA）联合刺激（PA ∶ OA=1 ∶ 2）对Ubd在小鼠肝细胞内表达情况的影响，将分离的小鼠原代肝细胞铺满提前加入鼠尾胶包被的六孔细胞培养盘，每孔细胞数量为60万个，设计多个时间点刺激，选择加入PA/OA刺激0 h（即未刺激对照）、3 h、6 h和12 h四个时间点。

1.2.4 过表达和敲低 Ubd 腺病毒构建

过表达质粒构建以小鼠原代肝细胞的cDNA作为模板，利用KOD FX Neo酶，通过聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）技术扩增出目的基因Ubd全长序列。将目的片段与BamHI酶与Xhol酶双酶切后的pHAGE-FLAG进行重组。将重组的质粒转入感受态细胞中扩菌培养，提取质粒并送入擎科生物测序比对序列。将测序正确的序列提取质粒。鼠源Ubd上游引物为5'-CTCACTATAGGGAGAGGATCCTCCATAGAAGACACCGGCGG-3'，下游引物为5'-TCGAGCGGCCGCGTACGCGCATCGATTCAGGGCAAGGCGG-3'。

敲低质粒构建：将上下游sg引物以退火的方式制备成双链。利用ESP31酶对慢病毒CRISPRv2质粒进行酶切（37 °C水浴），完成后对产物利用试剂盒进行回收。将退火后的双链sg序列和酶切完成的CRISPRv2载体用Ligation high酶进行连接（16 °C）。连接完成后进行转化、筛选、质粒提取。SgUbd上游引物序列为5'-CACCTTGTCCGTTCAGACCATGG-3'，下游引物序列为-AAACCCATTGGTCTGAACGGACAA-3'。

1.2.5 Ubd在代谢功能障碍相关脂肪性肝炎中的功能实验

针对过表达/敲低Ubd的腺病毒感染小鼠原代肝细胞，利用PA/OA（PA ∶ OA=1 ∶ 2）进行造模。设计不同时间点及不同浓度PA/OA对小鼠原代肝细胞进行刺激造模。

1.2.6 RNA提取及实时荧光定量逆转录聚合酶链式反应

造模完成后，弃掉细胞培养液，并利用磷酸盐缓冲液（phosphate buffered saline，PBS）对细胞培养皿冲洗两遍后加入TRIzol试剂，按照说明书进行细胞RNA的提取，测定RNA的浓度，利用HiScript III逆转录试剂盒进行逆转录成cDNA后加入SYBR Green PCR Master Mix试剂进行PCR。所有基因mRNA的表达以β-actin为内参。每个孔设置两个复孔，用2-△△CT的方法对PCR数据进行分析得出mRNA的相对表达变化。Acc1上游引物序列为5'-AATGAACGTGCAATCCGATTTG-3'，下游引物序列为5'-ACTCCACATTTGCGTAATTGTTG-3'；Fasn上游引物序列为5'-GGAGGTGGTGATAGCC GGTAT-3'，下游引物序列为5'-TGGGTAATCCATA GAGCCCAG-3'；Cpt1a上游引物序列为5'-ACAA TTCCCCTCTGCTCTGC-3'，下游引物序列为5'-TACACGACAATGTGCCTGCT-3'；Srebp1c上游引物序列为5'-GACCCTACGAAGTGCACACA-3'，5'-TGTCGGGCTCAGAGTCACTA-3'；Tnfα上游引物序列为5'-CCGGGAGAAGAGGGATAGCTT-3'，下游引物序列为5'-TCGGACAGTCACTCACCA AGT-3'；Il-1β上游引物序列为5'-CGGACCCC AAAAGATGAAGGGCTG-3'，下游引物序列为5'- AGCTGCCACAGCTTCTCCACA-3'；Cxcl10上游引物序列为5'-ATCATCCCTGCGAGCCTATCCT-3'，下游引物序列为5'-GACCTTTTTTGGCTAAACGCTTT C-3'。

1.2.7 蛋白质免疫印迹检测蛋白表达水平

使用RIPA裂解液（含1×蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂），冰上裂解30 min，期间涡旋震荡3次。4 ℃ 12 000×g离心15 min，取上清。采用BCA法测定浓度，调整至相同浓度，按4 ∶ 1比例混合蛋白样品与5×SDS上样缓冲液，95 ℃煮沸10 min，冰上骤冷。配制分离胶（10%丙烯酰胺）和5％浓缩胶，灌注后插入梳齿，室温聚合30 min。上样量：20~40 μg/孔，同时加入预染蛋白Marker进行电泳。电泳条件：浓缩胶80 V，分离胶120 V，至溴酚蓝迁移至胶底部。利用甲醇活化PVDF膜1 min后转膜，转膜夹层的顺序：负极→海绵→滤纸→凝胶→膜→滤纸→海绵→正极。转膜条件：4 ℃预冷转膜液，恒流250 mA。利用5%脱脂奶粉溶于TBST，室温摇床封闭1 h。封闭完成后孵育一抗，一抗稀释：按说明书比例用封闭液稀释。条件：4 ℃摇床孵育过夜（或室温2 h）。TBST漂洗膜3次，每次5 min。HRP标记二抗（抗兔IgG），1 ∶ 5 000稀释，室温摇床1 h后洗涤最后显影，ECL发光液（A液 ∶ B液= 1 ∶ 1）均匀覆盖膜表面，避光孵育1 min。化学发光成像仪采集信号，优化曝光时间（1 s~ 10  min）。使用ImageJ 2.14.0软件分析条带灰度值，以内参β-actin标准化目标蛋白表达量。

1.2.8 细胞尼罗红染色

利用4%多聚甲醛固定后利用尼罗红染液染色，加入24孔细胞培养盘中（预先放入细胞爬片）孵育10~15 min，利用PBS洗三遍，将爬片取出，滴加DAPI荧光核酸染料倒置放到载玻片上进行拍照。

1.2.9 动物模型构建

本实验将动物随机分成NC-GFP、NC-Ubd-sgRNA、HFHC-GFP、HFHC-Ubd-sgRNA四个组，每组各6只小鼠，其中NC-GFP为对照组，给予正常饲料（10%~12%蛋白质，3%~6%脂肪，65%~75%碳水化合物）喂养；HFHC组为高脂高胆固醇饲养组（40%脂肪供能、20%果糖和2%胆固醇），用于诱导小鼠MASH模型。造模前四周分别注射AAV8-GFP和AAV8-Ubd-sgRNA。16周后进行样本取材，取小鼠血液分离血清，摘除肝脏分别制备福尔马林固定病理标本、OCT包埋剂固定组织标本及液氮速冻的分子生物学检测标本。

1.2.10 血清生化分析

为评估动物血清脂代谢紊乱程度及肝损伤程度，分别检测动物血清中的低密度脂蛋白胆固醇（low-density lipoprotein cholesterol，LDL-C）、天冬氨酸氨基转移酶（aspartate transaminase，AST）、丙氨酸氨基转移酶（alanine transaminase，ALT）、乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase，LDH），使用ADVIA2400化学系统分析仪进行分析。

1.2.11 组织学分析

①苏木精-伊红染色法（hematoxylin-eosin staining，HE）：将组织固定好后用石蜡包埋，制成5 μm的石蜡切片，按照烤片-脱蜡-水合-细胞核染色（苏木素）-分化-胞浆染色（伊红）-脱水-封片步骤进行染色，染色完成后在显微镜下观察并拍照；②油红O（oil red O，ORO）染色：将包埋在OCT中的组织在冰冻切片机中切片，制成8 μm的冰冻切片，按照4%多聚甲醛固定-浸泡-异丙醇处理-ORO染色-酒精分化-苏木素染核-甘油明胶封片步骤进行染色，在显微镜下观察并拍照；③天狼星红（picrosirius red，PSR）染色：将已经制好的蜡块进行5 μm切片制成石蜡切片，通过烤片-脱蜡-水和-PSR染色-分化-脱水-封片步骤进行染色，染色完成后在显微镜下观察并拍照；④免疫组化（immunohistochemistry，IHC）染色：将石蜡切片通过烤片-通透/抗原修复-封闭-CD11b一抗-二抗-DAB显色-苏木素染核步骤进行染色，染色完成后封片镜检。

1.2.12 统计分析

使用GraphPad Prism 9和SPSS 27.0软件进行统计分析，符合正态分布的计量资料以均数和标准差（）表示，两组间比较采用独立样本t 检验；不符合正态分布使用Mann-Whitney U检验；多组间比较使用方差分析。P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 肝脏中Ubd表达在代谢功能障碍相关脂肪性肝炎中显著上调

通过GEO数据库基因比对分析，分别对比正常小鼠及MASH模型、人类及MASH疾病中多个数据集，通过upset()函数对17个数据集中的1.5倍差异上调且P值符合条件的基因进行交集。筛选出多个显著上调的差异基因（图1-A），垂直红柱显示17个数据集的共有1.5倍差异上调基因数为16个，分别为Ubd、ANAX2、TREM2、LGALS3、CAPG、LPL、CCL2、TOP2A、CD52、EMP3、MKI67、TMSB10、TAGLN2、CCDC88A、S100A4、CRIP1。通过文献查阅发现多个基因在癌症中发挥重要作用，部分基因在MASH中作为炎症趋化因子，促进疾病进展[27-35]。通过分析这些差异基因的表达情况，对差异基因的Log2（FC）值进行排序，其中Ubd排名第一（图 1-B）。在GSE207856数据集中，表达差异倍数的对数值最为显著（图1-C）。采用小鼠原代肝细胞进行PA刺激以构建体外小鼠原代肝细胞内脂质沉积模型，通过在不同时间点进行造模，发现Ubd的mRNA表达水平显著提高（图1-D）。选择12 h为造模终点，选择PA/OA联合刺激造模以模拟MASH体外模型，发现Ubd蛋白的表达水平呈上升趋势（图1-E）。

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  图1 生物信息筛选及代谢功能障碍相关脂肪性肝炎体外模型 Ubd 表达

  Figure 1.Bioinformatics analysis and the expression of Ubd in vitro model of metabolic dysfunction-associated steatohepatitis

  注：A. 通过17个GSE数据富集差异基因表达情况；B. 筛选出的17个GSE数据集取表达上调的差异基因的FC值排序热图；C. Ubd在数据集中的表达情况；D. 棕榈酸/油酸不同时间刺激组与对照组肝细胞中Ubd的mRNA水平表达情况；E. 棕榈酸/油酸12小时刺激组与对照组肝细胞中Ubd蛋白水平表达的免疫印迹图及转录水平表达情况（n=3）。ns，无统计学意义；*P＜0.05，**P＜0.01。

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2.2 抑制Ubd能够改善棕榈酸/油酸诱导的肝细胞内脂质堆积

2.2.1 过表达Ubd促进棕榈酸/油酸刺激诱导的肝细胞脂质堆积及炎症反应

为探究UBD分子在MASH病理过程中发挥的具体调控机制，构建过表达Ubd腺病毒（Ad-Ubd），其中Ad-GFP作为对照，验证了腺病毒感染后细胞内过表达效率（图2-A）。在造模前将这两种腺病毒分别感染小鼠原代肝细胞，持续感染24 h后对细胞PA/OA刺激处理，模拟MASH环境。为进一步直观地评估Ubd在促进PA/OA刺激后细胞脂质堆积方面的作用，进行肝细胞尼罗红染色实验。结果显示，PA/OA刺激12  h后，小鼠肝细胞内的脂滴明显增大，而过表达Ubd的肝细胞中脂质的堆积程度显著高于对照组（图 2-B），这表明小鼠肝细胞过表达Ubd能够促进PA/OA刺激诱导的脂质的堆积。通过对造模后小鼠原代肝中甘油三酯（triglyceride，TG）检测，发现PA/OA刺激后小鼠肝细胞内的TG水平上升（图2-C）。此外，通过对mRNA水平进行检测，发现过表达Ubd能够显著上调PA/OA刺激后肝细胞内脂质合成基因（Acc1、Fasn、Srebp1c）水平，而脂质代谢相关基因（Cpt1a）转录水平表达降低（P＜0.05）。Tnfα、Il-1β及Cxcl10的mRNA水平也显著升高（P＜0.05）（图 2-D），表明过表达Ubd不仅促进了脂质的堆积，还可能通过调控这些炎症相关基因的表达来加剧炎症反 应。

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  图2 体外过表达 Ubd 在代谢功能障碍相关脂肪性肝炎中的功能

  Figure 2.The function of overexpression of Ubd in virto model of metabolic dysfunction-associated steatohepatitis

  注：A. 原代肝细胞中过表达Ubd效率检测结果；B. 过表达Ubd造模肝细胞尼罗红染色及定量结果（×63倍）（3次独立重复实验），标尺20  µm；C. 原代肝细胞造模后TG表达水平（n=3）；D. 检测过表达Ubd造模后脂质代谢及炎症相关因子的mRNA表达水平（3次独立重复实验）。ns，无统计学意义；*P＜0.05，**P＜0.01。

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2.2.2 敲低Ubd改善棕榈酸/油酸诱导的肝细胞脂质堆积及炎症反应

为进一步验证Ubd在MASH中的功能，设计并构建了敲低Ubd的腺病毒（Ad-shUbd），其中Ad-shGFP作为实验对照，并检测了构建效率（图 3-A）。敲低Ubd腺病毒感染小鼠原代肝细胞24 h后，实施PA/OA刺激以建立疾病模型。尼罗红染色结果显示，Ad-shUbd组的脂滴面积和数量均少于对照组，表明敲低Ubd能够减少PA/OA刺激诱导的肝细胞脂滴的产生和积累（图 3-B）。通过检测炎症和脂代谢相关基因的mRNA表达水平发现，在PA/OA刺激后，Ad-shUbd组Tnfα、Cxcl10、Il-1β的mRNA水平显著低于对照组（图3-C），并且调控脂质合成相关的基因Fasn、Srebp1c、Acc1的mRNA水平明显低于对照组，而脂肪酸氧化的关键基因Cpt1a显著高于对照组（P＜0.05）（图3-C）。综上可知，敲低Ubd能够有效减少PA/OA刺激诱导的肝细胞脂质堆积和细胞炎症产 生。

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  图3 体外敲低 Ubd 在代谢功能障碍相关脂肪性肝炎中的功能

  Figure 3.The function of knockdown Ubd in virto model of metabolic dysfunction-associated steatohepatitis

  注：A. 原代肝细胞中敲低Ubd效率检测结果；B. 敲低Ubd造模肝细胞尼罗红染色及定量结果（×63倍）（3次独立重复实验）：C. 检测脂质代谢及验证相关因子的mRNA表达水平（n=3）；ns，无统计学意义；*P＜0.05，**P＜0.01。

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2.3 敲除Ubd缓解小鼠肝炎进程

2.3.1 肝脏特异性敲除Ubd减少小鼠肝脂质堆积

为深入研究Ubd在调控MASH中的作用，设计并构建了由高脂高胆固醇饲料（high-fat/ high- cholesterol，HFHC）诱导的MASH小鼠模型。构建Ubd肝脏特异性敲除小鼠，并对敲除效率进行了检测（图4-A）。在造模前4周，给小鼠尾静脉注射预先构建好的腺相关病毒，AAV8-GFP作为对照组，AAV8-Ubd-sgRNA作为实验组，以特异性敲除小鼠肝脏中Ubd的表达。随后进行16周的HFHC造模，并在造模结束后获取实验材料。对小鼠的血清样本进行血生化分析，结果显示，与对照组相比，造模组小鼠血清LDL-C含量显著上升，而在造模组中敲除Ubd能够显著降低LDL-C含量，表明敲除Ubd具有降低LDL-C表达并缓解脂代谢紊乱的作用（图4-B）。进一步对小鼠肝脏组织进行组织学分析，包括HE染色及ORO染色。HE染色结果显示，HFHC饲料喂养的小鼠肝脏脂肪变性程度明显高于正常对照组喂养且未敲除Ubd的小鼠。值得注意的是，在HFHC喂养的条件下，敲除Ubd小鼠与未敲除Ubd的小鼠相比，肝脏中的脂滴明显减少（图 4-C）。ORO染色更直观地显示，HFHC喂养且敲除Ubd的小鼠肝脏脂滴显著少于HFHC喂养但未敲除Ubd的小鼠（图 4-C）。

2.3.2 敲除Ubd能够缓解小鼠肝脏损伤

为深入研究敲除Ubd对小鼠肝脏损伤的影响，系统分析了小鼠的血清血生化指标，通过对比正常饲料饲养（NC）与高脂高胆固醇饮食（HFHC）饲养条件下小鼠的血清样本，发现HFHC组的小鼠血浆中ALT、AST、LDH浓度均显著升高（图4-D）。敲除Ubd表达后，ALT与AST的水平均显著降低，表明敲除Ubd可能有效减缓肝脏的受损程度，并能够改善脂质造模引起的肝脏损伤。为更精准地评估Ubd在MASH发展中的作用，采用PSR染色和IHC染色对小鼠肝脏组织进行组织病理学分析。染色结果显示，HFHC诱导的小鼠肝脏表现出更严重的纤维化病变，炎症细胞数量更多，而在HFHC组中敲除Ubd的小鼠，其肝脏纤维化程度相较于未敲除Ubd的对照组有明显降低，炎症明显减轻（图 4-E）。

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  图4 敲除Ubd对小鼠肝细胞中脂质代谢及炎症应答的影响

  Figure 4.The impact of Ubd knockout on fatty acid metabolism and inflammatory response in mouse liver tissue

  注：A. 小鼠造模流程及敲除效率检测图；B. 小鼠血清中低密度脂蛋白胆固醇含量检测（n=6）；C. 小鼠肝脏组织苏木精-伊红（HE）染色、油红O（ORO）染色及定量结果（×200倍）（n=6），标尺100 µm ；D. 小鼠血清中肝细胞损伤相关蛋白含量检测（n=6）；E. 小鼠肝脏组织PSR、IHC染色及定量结果（×200倍）（n=6），标尺100 µm；ns，无统计学意义；*P＜0.05，**P＜0.01。

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2.4 Ubd显著抑制脂肪酸氧化，加重代谢功能障碍相关脂肪性肝炎进展

为了更深入地分析Ubd在小鼠原代肝细胞中对脂质代谢及炎症发生的影响，取HFHC造模组的小鼠肝脏组织，提取了小鼠肝脏组织RNA，并进行RNA-seq测序。首先对两个组别进行主成分分析（principle component analysis，PCA），将数据去中心化（图 5-A）。对组中的差异基因进行基因集富集分析（gene set enrichment analysis，GSEA）发现，在小鼠MASH模型中敲除Ubd，脂质代谢、炎症、纤维化及细胞死亡的关键通路均受到显著影响（图 5-B）。进一步通过基因本体论（Gene Ontology，GO）富集分析比较HFHC-GFP和HFHC-Ubd-sgRNA组，发现Ubd参与脂质代谢的生物学过程（图5-C）。进一步对差异基因在细胞死亡、纤维化、炎症、脂质通路进行富集分析，结果显示，与敲除组相比，对照组在细胞死亡、脂质代谢、纤维化及炎症通路中显著富集，这表明Ubd影响并参与到这些通路中（图5-D）。为了探究Ubd与炎症通路的关系，对两组差异基因进行京都基因与基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）分析，富集了相关的功能通路，结果显示，Ubd与WNT信号通路、TNF信号通路等炎症通路呈现显著的相关性（图5-E）。通过抑制Ubd可以影响炎症通路，从而延缓MASH疾病发展进程。进一步绘制参与脂肪酸代谢、细胞死亡、炎症的差异基因表达热图，发现参与炎症的基因Illrn、Nupr1、Egr1、Osmr、Orm1等的表达下调，参与脂肪酸合成相关的基因Dkk3、Egr1、Akr1b1等表达下调，参与细胞死亡相关的基因Cd74、Nupr1、Dyk3、Aen、Cd44等表达下调，结果显示，敲除Ubd可能通过促进脂肪酸氧化，抑制脂肪酸合成，从而改善HFHC诱导的MASH。

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  图5 Ubd影响的相关通路

  Figure 5.Relevant pathways affected by Ubd

  注：A. 对HFHC敲低的两组进行PCA聚类分析结果；B. HFHC-GFP组和HFHC-Ubd-sgRNA组差异基因富集的功能通路基因富集分析；C. 两组差异基因GO数据库在生物过程、细胞组分、分子功能的富集分析；D. 两组差异基因GO数据库通路比较分析；E. 两组差异基因经KEGG数据库分析后富集的功能通路；F. HFHC-GFP组和HFHC-Ubd-sgRNA组差异基因在脂质代谢、纤维化、炎症及细胞死亡相关通路的差异基因的表达变化。红色代表表达上调，蓝色代表表达下调。

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3 讨论

MASH作为MASLD的一种进行性病理演变形态，已成为全球范围内肝病发病的主要病因之一 [36]。据估计，中国成年人中MAFLD的患病率已达29.2%，而MASH作为MAFLD中一种较严重的临床类型，其患病率也随之增加[37]。MASH的临床表现通常涵盖了肝脏脂肪变性、炎症反应和纤维化过程，若未能在疾病初期采取有效干预措施，患者将面临肝细胞性肝癌（hepatocellular carcinoma，HCC）、肝硬化等高风险并发症的威胁[38]。鉴于目前针对MASH的药物治疗手段较为有限，深入探索该疾病的内在分子调控机制并挖掘其潜在治疗靶点，对于开发新型治疗方案及策略具有重要意义[39]。

UBD作为一种类泛素蛋白，被发现在MASLD、MASH及HCC中有过表达状态[40-41]。本研究通过对多个小鼠和人类肝组织转录组数据集进行生物信息学分析，从大量差异表达基因中筛选出UBD作为潜在研究靶点。对比正常小鼠与蛋氨酸、胆碱联合缺乏饲料（methionine- and choline deficient diet，MCD）小鼠、正常小鼠与HFHC饲养小鼠以及人类健康对照与MASH患者的基因表达后，发现Ubd在MASH小鼠及患者中均显著上调。然而，目前对于UBD在脂质代谢中的报道较少。既往研究表明，UBD可能通过调节脂质合成和影响相关代谢途径在MASH中发挥作用[42]。而本研究通过体内外实验均表明，UBD对MASH疾病进程具有显著影响。在体外模型中，过表达Ubd可促进PA/OA刺激诱导的小鼠原代肝细胞脂质堆积及脂代谢相关基因的表达，敲低Ubd则能改善PA/OA诱导的肝细胞脂质堆积及脂质代谢相关基因表达。在体内模型中，敲除Ubd可缓解HFHC饲料诱导的血脂代谢紊乱、肝功能损伤，同时减轻肝脏纤维化程度和炎症细胞浸润，提示肝脏特异性敲除Ubd能有效缓解MASH发展进程，提示UBD作为MASH及脂代谢相关疾病治疗靶点的潜力。

利用转录组学分析UBD潜在调控MASH的分子机制发现，UBD可能通过影响脂肪酸代谢和炎症通路来调控MASH进程。一方面，敲除Ubd后，脂肪酸代谢途径显著激活，线粒体外膜上的CPT I是脂肪酸进入线粒体进行氧化分解的关键酶[43]。本研究中，降低Ubd在肝细胞中的水平后，参与脂肪酸降解的基因表达上调，脂肪酸合成相关基因表达下调，提示UBD在细胞中可能间接影响CPT I等脂肪酸氧化基因的转录，进而阻碍脂肪酸氧化途径。另一方面，UBD与炎症反应紧密相连。在类风湿关节炎中，UBD可通过激活p38 MAPK通路促进疾病进展[44]。过表达UBD会显著上调相关炎症因子的mRNA水平，敲低UBD则降低炎症因子（TNFα、CXCL10、IL- 1β）的mRNA水平。同时，Ubd过表达可刺激核因子κB（NF-κB），激活炎症通路，从而诱导炎症因子的产生，促进炎症反应的发生发展[45]。在MASH中，Ubd可能通过影响巨噬细胞的功能和极化状态，进而影响炎症反应。UBD还可能与巨噬细胞中的其他分子相互作用，调节其在MASH中的炎症反应[46]，提示UBD在MASH的发病过程中起着重要作用。通过生物信息学分析发现Ubd可能调控炎症通路，影响肝组织内P53、MAPK、Wnt、FcεRI、TNF、JAK-STAT、NF-κB等炎症信号通路，同时也影响了脂肪酸合成通路。表明UBD能够调控炎症相关基因表达影响细胞内炎症通路，并参与脂肪酸的代谢调控。目前认为，线粒体外膜上的CPT I能够将长链脂肪酸与肉碱结合形成脂酰肉碱，从而使脂肪酸能够通过线粒体内膜上的转运体进入线粒体基质，为脂肪酸的氧化分解创造条件[47]。本研究中的UBD分子可能影响CPT I的转录，从而影响脂肪酸的氧化分解。脂肪生成相关基因（SREBP1c、FASN、ACC1）在PA/OA诱导的原代肝细胞中均与Ubd的转录表达水平呈正相关关系。这些证据都显示出研究UBD分子在调控脂质代谢方面的重要意义。在纤维化进展中，UBD可能通过影响肝星状细胞的活化和增殖，参与肝纤维化的形成，从而加剧肝纤维化的发展，此外，UBD可能参与调节细胞外基质的合成和降解，影响肝纤维化的程度[48]。UBD在肝实质细胞与免疫细胞中作用的具体分子靶点及其下游效应分子有待进一步研究。本研究存在一定局限性：首先，体内研究缺乏肝细胞特异性Ubd过表达动物模型的验证，限制了对其疾病阶段特异性功能的全面评估；其次，UBD调控脂肪酸氧化的直接靶点及其具体的分子机制尚未完全阐明。

综上，本研究发现肝细胞UBD对MASH具有促进作用，其机制可能是通过抑制脂肪酸氧化分解加重MASH。该发现为深入理解MASH发病机制并制定防治措施提供了理论依据。

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