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目的 通过两样本孟德尔随机化（Mendelian randomization，MR）研究评估多不饱和脂肪酸（polyunsaturated fatty acids，PUFA）与结直肠癌（colorectal cancer，CRC）之间的因果关系。
方法 基于全基因关联研究（genome-wide association study，GWAS）数据，以PUFA相关遗传变异为工具变量，从GWAS数据集提取CRC作为结局指标。采用逆方差加权法、MR-Egger回归和加权中位数法作为主要分析方法，评价ω-3脂肪酸、ω-6脂肪酸、ω-3脂肪酸/总脂肪酸比值、ω-6脂肪酸/总脂肪酸比值、ω-6/ω-3脂肪酸比值与CRC风险的因果关系。
结果 逆方差加权法分析结果显示，ω-3脂肪酸[OR=1.14，95%CI（1.06，1.23），P=0.014]、ω-6脂肪酸[OR=1.10，95%CI（1.03，1.18），P=0.007]、ω-6/ω-3脂肪酸比值[OR=0.91，95%CI（0.84，0.99），P=0.006]与CRC有直接因果关系。ω-3脂肪酸/总脂肪酸比值[OR=1.09，95%CI（0.94，1.26），P=0.164]、ω-6脂肪酸/总脂肪酸比值[OR=1.07，95%CI（0.97，1.18），P=0.226]与CRC不存在因果关系。
结论 MR分析结果表明，ω-3脂肪酸、ω-6脂肪酸、ω-6/ω-3脂肪酸比值与CRC之间存在因果关系，而ω-3脂肪酸/总脂肪酸比值、ω-6脂肪酸/总脂肪酸比值无因果关系。
结直肠癌（colorectal cancer，CRC）是临床较常见的消化系统恶性肿瘤之一，目前已是全球第三大最常诊断的癌症[1]。在中国，CRC的死亡率位居所有恶性肿瘤第四位[2]。随着人口老龄化和发病人群年轻化，CRC进一步威胁着人类的生命安全。CRC的发病原因复杂，与饮食习惯、年龄、遗传因素等密切相关[3]。有研究指出，ω-3多不饱和脂肪酸（omega-3 polyunsaturated fatty acids，ω-3 PUFA）可以调控细胞凋亡，对CRC有一定的抑制作用[4]，但其结论存在争议。ω-6多不饱和脂肪酸（omega-6 polyunsaturated fatty acids，ω-6 PUFA）在细胞凋亡中的调控作用仍未确定，有研究指出其可以激活细胞凋亡，也有研究表明其对细胞凋亡有抑制作用[5]。可以明确的是，PUFA与CRC微环境的形成、肿瘤细胞的生命活动有密切联系[6-7]。
孟德尔随机化（Mendelian randomization，MR）是流行病学领域一种新兴的数据分析方法，利用单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphisms，SNPs），使用暴露因素强相关的遗传变异作为工具变量，以评估暴露因素与结局之间的因果关系[8-9]。探讨PUFA对CRC的影响，对于非药物防治CRC具有重要意义。本研究利用大规模开放性全基因组关联研究（genome-wide association study，GWAS）数据进行双样本MR分析，旨在探索PUFA与CRC的因果关系。
1 资料与方法
1.1 数据来源
采用两样本MR分析评估PUFA与CRC间的因果关系，MR需要满足三个关键假设[10]：① 相关性假设：工具变量必须与暴露之间强相关；② 独立性假设：所选工具变量与暴露和结局之间的混淆因素不相关；③排他性假设：工具变量不会直接影响结果，只能通过暴露影响结局。本研究所使用的数据库是MR BASE数据库（http://www.mrbase.org/），此数据库包含了大规模全基因组关联研究GWAS数据库（https://gwas.mrcieu.ac.uk/）中的数据。选择公开可用的数据集ω-3脂肪酸、ω-6脂肪酸、ω-3脂肪酸/总脂肪酸比值、ω-6脂肪酸/总脂肪酸比值、ω-6/ω-3脂肪酸比值（https://gwas.mrcieu.ac.uk/datasets/met-d-Omega_6_by_Omega_3/）中的SNPs作为工具变量，CRC作为结局变量，见图1、表1。
1.2 筛选工具变量
在显著性阈值水平上（P＜5×10-6）确定与工具和结局变量相关的独立SNPs，工具变量 [14]限制为连锁不平衡水平较低的独立SNPs，以LD-R2＜0.001为截断值，设置Clumping distance为10 000 kb，以保证SNPs之间的独立 性，一定程度上防止具有对称等位基因的SNPs颠倒因果效应的方向。经数据分析与筛选，本研究5个暴露因素最终分别纳入19、33、72、121、79个SNPs。
1.3 MR分析方法
本研究主要采用的分析方法为随机效应模型逆方差加权法[15]（inverse-variance weighted，IVW），同时使用MR-Egger回归法、加权中位数法（weighted median method，WME）、单纯模型（simple mode）和加权模型（weighted mode）四种方法[16-19]作为补充，进一步保证MR结果的有效性和稳健性。若IVW方法的P值小于0.05，且与MR-Egger回归法、WME、单纯模型和加权模型的Beta值正负方向大致一致或完全一致，则认为本研究的因果估计是显著的。
1.4 异质性检验
采用Cochran Q检验评估SNPs间的统计学异质性，主要关注IVW结果，以P＜0.05为截断值，认为SNPs间存在统计学异质性。
1.5 敏感性分析
敏感性分析主要采用3种方法：①计算去除回文SNPs或多效性SNPs后的效应值，规避效应等位基因识别错误导致的结果不准确；②采用MR-Egger截距法检测水平多效性（即在水平方向上的不一致性），以P＞0.05为截断值，认为结果不存在明显的水平多效性；③采用留一法[20]进行敏感性分析，判断MR结果对单个工具变量的敏感性，以评估MR分析结果的稳健性。
1.6 统计学方法
利用MR base平台（App version：1.4.3 8a77eb，R version：4.0.3）完成数据导入、工具变量筛选，并进行MR分析、异质性检验和敏感性分析，同时绘制森林图、散点图、漏斗图。
2 结果
2.1 MR分析
IVW结果显示，ω-3脂肪酸、ω-6脂肪酸、ω-6/ω-3脂肪酸比值与CRC发病风险的关联效应具有统计学意义（P＜0.05）。其中，ω-3脂肪酸的MR-Egger回归法、WME、单纯模型、加权模型，ω-6脂肪酸的MR-Egger回归法、单纯模型，ω-6/ω-3脂肪酸比值的单纯模型均显示其与CRC发病风险之间不存在关联（P＞0.05）。但是，ω-3脂肪酸检验方法的Beta值正负方向基本一致，ω-6脂肪酸和ω-6/ω-3脂肪酸比值检验方法的Beta值正负方向完全一致，则认为ω-3脂肪酸和ω-6脂肪酸升高是CRC的危险因素，ω-6/ω-3脂肪酸比值升高是CRC的保护因素，即ω-3脂肪酸水平每增加一个标准差，CRC的风险增加14%；ω-6脂肪酸水平每增加一个标准差，CRC的风险增加10%；ω-6/ω-3脂肪酸比值每升高一个标准差，CRC的风险降低8%。IVW结果显示，ω-3/总脂肪酸比值和ω-6/总脂肪酸比值与CRC发病风险的关联效应无统计学意义（P＞0.05），见表2、图2、图3。
2.2 异质性检验
Cochran Q检验结果显示，ω-3脂肪酸、ω-3/总脂肪酸比值、ω-6/总脂肪酸比值和ω-6/ω-3脂肪酸比值的SNPs之间存在显著的统计学异质性（P＜0.05），而ω-6脂肪酸的SNPs之间不存在显著的统计学异质性（P＞0.05），见表3。
2.3 敏感性分析
在去除回文SNPs或多效性SNPs后，发现各暴露因素结果稳健。MR-Egger截距在一定程度上表明ω-3脂肪酸、ω-6脂肪酸、ω-3/总脂肪酸比值、ω-6/总脂肪酸比值不存在水平多效性（P ＞0.05），ω-6/ω-3脂肪酸比值存在水平多效性（P=0.021），见表3。留一法分析结果显示，各个暴露因素纳入分析的SNPs对结果无显著影响，表明总体结果不是由单个基因驱动，无单一SNPs对结果产生实质性影响，结果具有显著的可靠性，见图4。虽然暴露因素ω-3脂肪酸的整体结果在一定程度上受rs174546影响，但影响程度较小，故认为结果未产生实质性偏差。漏斗图分析结果显示，ω-3脂肪酸漏斗图不存在对称性，ω-3/总脂肪酸比值、ω-6/总脂肪酸比值和ω-6/ω-3脂肪酸比值的漏斗图存在较为理想的对称性，ω-6脂肪酸的漏斗图存在一定程度的对称性，但对称性不理想，提示本研究中ω-6脂肪酸、ω-3脂肪酸/总脂肪酸比值、ω-6脂肪酸/总脂肪酸比值、ω-6/ω-3脂肪酸比值使用的工具变量SNPs推断出的因果关系受潜在因素的影响相对较小，见图5。
3 讨论
本研究采用MR模型系统评估了PUFA与CRC的因果关联，结果表明，ω-3脂肪酸、ω-6脂肪酸升高是CRC的危险因素，ω-6/ω-3脂肪酸比值升高是CRC的保护因素。但ω-6/ω-3脂肪酸比值的SNPs间存在一定程度的水平多效性，该结果有待未来的研究进一步探讨。
PUFA是人体的重要组成部分，同时也参与多种代谢。一项纳入1 613名患者的Meta分析结果显示，ω-3脂肪酸显著提高了体液免疫功能指标，可能用于术后治疗CRC患者的免疫支持[21]，这与本研究中ω-3脂肪酸为CRC的危险因素的结论并不一致。有研究认为，ω-3脂肪酸作为免疫营养素，可能通过提高T细胞的免疫功能指标抬高体液免疫功能指标，以改善CRC患者的免疫状况[22]。本研究与部分研究[23-24]的结果相符合，Zhou等的研究发现，在一定条件下，ω-3脂肪酸水平升高会增加CRC的发病风险，同时也提出ω-6/ω-3比值在CRC发展中起保护作用[23]；Khankari等的研究也发现，特定的ω-3脂肪酸二十碳五烯酸、二十二碳六烯酸可能增加CRC的发病风险[24]。ω-3脂肪酸对CRC的调控是多途径、多步骤、多因素的，其干预CRC发生与发展的机制仍需进一步的研究与探讨。相关研究表明，ω-6脂肪酸水平与CRC的发生相关[25]。既往研究发现，ω-6脂肪酸及代谢产物形成促进炎症发生及肿瘤生长的微环境，促进癌症的发展[26]，调整ω-6脂肪酸水平对于防治CRC具有积极作用。Yang等的研究发现，ω-6脂肪酸的代谢可能在CRC炎症驱动的肿瘤发生演变中发挥重要作用，并且可能是预后的潜在标志物[27]。
本研究具有一定的临床意义，明确了调节饮食中的PUFA摄入，特别是调整饮食中ω-3脂肪酸和ω-6脂肪酸的比例，可能有助于降低CRC的风险。本研究将在一定程度上指导CRC的预防和治疗，为临床实践和科学研究提供参考。本研究具有一定优势，与传统观察性研究相比，MR研究与随机对照试验类似且更不容易被混杂因素影响，同时能够避免反向因果关系[28]。横断面研究与小样本数据研究易于遭受外界无关因素干扰且通常花费巨大，而MR基于GWAS等公共数据库，样本量大，能尽可能避免混杂因素。本研究也存在一定局限性：一是所有的GWAS数据均来自欧洲血统的个体，不同血统人群之间的生活习惯、环境因素、遗传变异等存在差异，无法确定研究结论是否具有普遍性以用于其他人群；二是本研究使用了汇总数据而非个体级别的数据，因此无法进行亚组分析以细化因果关系。
综上所述，本研究提供的遗传学证据支持CRC与ω-3脂肪酸水平、ω-6脂肪酸水平和ω-6/ω-3脂肪酸比值之间存在因果关联，但CRC与ω-6/ω-3脂肪酸比值之间的因果关系尚不能很好地解释，CRC与ω-3脂肪酸/总脂肪酸比值、ω-6脂肪酸/总脂肪酸比值之间尚未发现因果关联。未来有待进一步研究PUFA与CRC之间的因果关联，探究PUFA在防治CRC上的潜力。
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