目的  基于生物信息学和孟德尔随机化分析研究溃疡性结肠炎（ulcerative colitis，UC）具有诊断和治疗潜力的内质网应激（endoplasmic reticulum stress，ERS）相关基因，并进行相关基因的基因集富集分析（Gene Set Enrichment Analysis，GSEA）、基因本体论（Gene Ontology，GO）和京都基因和基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Gnomes，KEGG）分析，构建ceRNA调控网络。

方法  从高通量基因表达数据库（Gene Expression Omnibus，GEO）获取UC患者和健康对照者的结肠组织基因表达谱及临床信息，采用差异表达分析法筛选与UC相关的差异基因，从GeneCards数据库下载ERS相关基因集，差异基因和ERS相关基因取交集得到差异ERS相关基因，利用GO和KEGG对差异ERS相关基因进行分析。采用Lasso回归、支持向量机（support vector machine，SVM）、随机森林树三种方法筛选并取交集得到UC疾病特征基因，利用表达数量性状位点（expression quantitative trait locus，eQTL）暴露数据和UC结局数据进行孟德尔随机化分析，得到具有诊断和治疗潜力的目标基因。采用GSEA、基因集变异分析（Gene Set Variation Analysis，GSVA）和CIBERSORT免疫细胞浸润分析探索目标基因与免疫细胞组成之间的相关性。预测与目标基因表达相关的miRNA和lncRNA，并构建ceRNA调控网络。

结果  孟德尔随机化结果显示，基因ANXA5增加UC发病风险。GSEA结果显示，目标基因主要富集通路包括趋化因子信号通路、细胞因子受体相互作用通路、造血细胞调控信号通路、JAK/STAT信号通路、利什曼原虫感染等。GSVA结果显示，补体和凝血级联等通路上调，缬氨酸亮氨酸和异亮氨酸降解等通路下调。免疫细胞浸润分析结果显示，基因ANXA5正调控中性白细胞、活化肥大细胞等，负调控静止树突状细胞、巨噬细胞M2等。鉴定出3个关键miRNA和15个lncRNA，并绘制出ceRNA调控网络。

结论  本研究预测了ERS相关基因ANXA5增加UC发病风险，鉴定出的miRNA、lncRNA或可作为UC的生物标志物。

溃疡性结肠炎（ulcerative colitis，UC）是一种以交替复发和缓解为特点的炎症性肠病，其病变部位局限于大肠黏膜及黏膜下层，临床主要表现为腹泻、腹痛及黏液脓血便[1]，对患者的健康状况和生活质量造成严重影响。UC的发病涉及多个因素，包括宿主遗传易感性、肠道微生物群、环境因素和免疫异常[2]。研究表明，肠上皮细胞（intestinal epithelial cell，IEC）的内质网应激（endoplasmic reticulum stress，ERS）失衡加速了UC的进展[3]。适度的ERS可以保持肠道环境的平衡，但过量的ERS会通过调节ERS易感性基因导致IEC凋亡与肠道粘膜屏障功能障碍，并产生促炎细胞因子，导致UC的发生[4]。然而，目前对UC发病过程中ERS相关的分子机制研究较少，特别是ERS相关基因与UC发病间的关系相关研究相对较少。本研究以ERS相关基因与疾病间关系为切入点，选择关键的ERS相关基因与UC发病机制中的生物关系作为研究方向，进行功能富集分析、免疫细胞浸润分析，以确定ERS相关基因对UC的影响，以期为UC的诊断和治疗策略提供新的视角。

1 资料与方法

1.1 数据获取和预处理

以“ulcerative colitis”为关键词在基因表达数据库（Gene Expression Omnibus，GEO）（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/）进行检索，限制“Entry type”为“Series”，限制“study type”为“Expression profiling by array”，限制“Top Organisms”为“Homo sapiens”，通过筛选样本量及对照组数据，获得GSE105074、GSE92415、GSE206285、GSE87466、GSE53306基因芯片数据作为研究对象，所在平台分别为GPL10558、GPL13158、GPL13158、GPL13158、GPL14951。利用perl语言对数据进行处理，完成数据注释，通过R 4.4.0软件对所有数据进行矫正。选择GSE105074为验证组，其余为训练组，通过R软件的limma包和sva包对4组训练组数据进行合并和批量矫正，对矫正前后数据进行主成分分析（principal component analysis，PCA）。最终纳入899个样本，其中UC组827个样本,对照组72个样本。

1.2 筛选差异表达基因

采用R 4.4.0软件进行差异基因筛选，筛选标准为fold change＞1.5、P＜0.05[5]，同时绘制差异基因的热图及火山图。

1.3 ERS相关基因的GO和KEGG分析

从GeneCards下载ERS相关基因集，差异基因和ERS相关基因取交集得到差异ERS相关基因,并绘制差异ERS相关基因热图。采用R 4.4.0软件对交集基因进行功能富集分析，包括基因本体论（Gene Ontology，GO）、京都基因和基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Gnomes，KEGG）分析，设定P＜0.05作为筛选标准，用于确定显著富集的基因集条目。

1.4 筛选特征基因

分别采用Lasso回归、支持向量机（support vector machine，SVM）、随机森林树三种方法筛选出疾病特征基因，三种方法所得结果取交集得到疾病特征基因。采用受试者工作特征曲线（receiver operating characteristic curve，ROC）对特征基因进行验证。

1.5 孟德尔随机化分析

从全基因组关联分析数据库（Genome-wide association study，GWAS）（https://gwas.mrcieu.ac.uk/）下载UC表达数量性状位点（expression quantitative trait locus，eQTL）暴露数据，并从FinnGen数据库（https://www.finngen.fi/en/access_results）下载UC结局数据,随后进行孟德尔随机化分析，得到具有诊断和治疗潜力的目标基因，孟德尔随机化分析的暴露因素为基因ANXA5，结局为UC，选用逆方差加权法（inverse variance weighted）、加权中位数估计（weighted median）、MR-Egger法、简单模式（simple mode）、加权模式（weighted mode）五种方法进行分析，其中逆方差加权法以P＜0.05作为筛选标准。

1.6 基因集和免疫细胞分析

通过基因集富集分析（Gene Set Enrichment Analysis，GSEA）来分析观察目标基因高低表达组功能通路活跃情况，采用基因集变异分析（Gene Set Variation Analysis，GSVA）来分析目标基因高低表达组功能通路表达差异情况。采用CIBERSORT免疫细胞浸润分析探索潜在的生物学机制，分析目标基因与免疫细胞组成之间的相关性。

1.7 构建ceRNA调控网络

分别利用经典的miRNA靶基因数据库（miRanda、Targetscan、miRDB）预测与目标基因表达相关的miRNA,三个数据库预测结果取交集得到目标基因表达相关的miRNA。利用Spongescan数据库预测与目标基因表达相关的lncRNA，并使用Cytoscape 3.10.2软件构建ceRNA调控网络。

2 结果

2.1 数据处理结果

主成分分析矫正前图形显示，不同实验组数据是分开的，来自不同实验组数据存在批次效应，见图1-A；矫正后图形显示，不同实验组数据是随机打乱的，说明已经消除批次效应，见图1-B。

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  图1 主成分分析矫正前后图形对比

  Figure 1.Comparison of figures before and after principal component analysis correction

  注：A. 主成分分析矫正前图形；B. 主成分分析矫正后图形。

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2.2 差异基因筛选结果

共筛选出1 571个差异基因，其中940个基因上调，631个基因下调。同时得到差异基因的热图（图2-A）及火山图（图2-B）。

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  图2 差异基因表达热图和火山图

  Figure 2.Heat map and volcano diagram of differential gene expression

  注：A. 差异基因表达热图；B. 差异基因表达火山图。

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2.3 差异ERS相关基因的GO和KEGG分析

差异ERS相关基因热图见图3-A。GO分析结果显示，ERS相关基因主要参与的生化过程包括对ERS的反应、对ERS反应的调控、ERS反应中的内在凋亡信号通路、内在凋亡信号通路、内源性凋亡信号通路的调控、对细菌源性分子的反应、ERS诱导的内源性凋亡信号通路的调控、对脂多糖的反应、ERS反应的负调控、凋亡信号通路的调控；ERS相关基因主要参与的分子组成包括内质网腔、内质网蛋白复合物、内质网伴侣复合体、内吞囊泡、内质网出口位点、包被囊泡、分泌颗粒腔等；ERS相关基因主要参与的分子功能为肽结合、抗氧化活动、错误折叠蛋白的结合、酰胺结合、过氧化物酶活动、作用于过氧化物作为受体的氧化还原酶活动、谷胱甘肽过氧化物酶活动、蛋白质折叠伴侣结合等，见图3-B至图3-D。KEGG分析结果显示，ERS相关基因主要富集条目为肿瘤坏死因子信号通路、脂质与动脉粥样硬化、内质网中的蛋白质加工通路、肺结核、IL^-17信号通路、利什曼病、流体剪切应力与动脉粥样硬化、疟疾、类风湿性关节炎、非酒精性脂肪肝、AGE-RAGE信号通路在糖尿病并发症中的作用、恰加斯病、谷胱甘肽代谢、Th17细胞分化、炎症性肠病、化学致癌作用−DNA加合物、疱疹病毒感染相关卡波西肉瘤、百日咳、麻疹、非洲锥虫病、神经退行性病变、移植物抗宿主病、人巨细胞病毒感染等，见图3-E、图3-F。

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  图3 差异ERS相关基因热图、GO分析及KEGG分析结果

  Figure 3.Heatmap of differential ERS-associated genes and results of GO and KEGG analysis

  注：A. 差异ERS相关基因热图；B~D. 差异ERS相关基因GO分析；E~F. 差异ERS相关基因KEGG分析。

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2.4 特征基因筛选结果

采用Lasso回归筛选出36个疾病特征基因，采用SVM筛选出16个疾病特征基因，采用随机森林树方法筛选出46个疾病特征基因，取交集得到11个UC疾病特征基因，分别为CCL2、UGT1A6、PDIA4、ANXA5、KDELR3、VCAM1、HYOU1、VIM、NOD2、DNAJB9、PCSK1。如图4所示，11个UC疾病特征基因的ROC曲线下面积为0.990（95%CI：0.982~0.996）。

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  图4 溃疡性结肠炎特征基因的ROC曲线

  Figure 4.ROC curves of ulcerative colitis characteristic genes

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2.5 孟德尔随机化分析

孟德尔随机化分析的暴露因素为ANXA5基因，结局变量为UC，逆方差加权法的P值为0.028，OR值为1.077，单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism，SNP）的数量为15，逆方差加权法和MR Egger法异质性检验P值均大于0.05，多效性检验P值大于0.05，同时得到散点图（图5-A）、森林图（图5-B）、漏斗图（图5-C）、留一法敏感性分析结果（图5-D），结果显示,随着ANXA5基因表达水平升高，UC发病风险相应增加。

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  图5 孟德尔随机化分析结果

  Figure 5.Results of Mendelian randomization analysis

  注：A. 散点图；B. 森林图；C. 漏斗图；D. 留一法敏感性分析。

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2.6 基因集和免疫细胞分析

GSEA结果显示，ANXA5基因高表达组功能通路活跃的是化学动力学信号通路、细胞因子受体相互作用、造血细胞调控信号通路、杰纳斯激酶-信号转导子和转录激活子（Janus kinase-signal transducer and activator of transcription，JAK-STAT）通路、利什曼原虫感染，ANXA5基因低表达组功能或通路活跃的是丁酸酯代谢、药物代谢细胞色素P450、通过细胞色素P450外源性代谢、近端肾小管管壁碳酸化、视黄醇代谢，见 图6-A、图6-B。GSVA结果显示，ANXA5基因高表达组中补体和凝血级联、JAK-STAT通路、细胞因子受体相互作用、朊病毒疾病、利什曼原虫感染、系统性红斑狼疮、细胞外基质受体相互作用、蛋白质分泌、Toll样受体（toll-like receptors，TLRs）信号通路、糖胺聚糖生物合成硫酸软骨素这些功能或通路表达明显上调，而缬氨酸亮氨酸和异亮氨酸降解、过氧化物酶体、甘油磷脂代谢、丙酮酸代谢、近端肾小管管壁碳酸化、肌醇磷酸代谢、年青的成年发病型糖尿病、味觉转导、丁酸酯代谢、萜类主链生物合成这些功或能通路在ANXA5高表达组明显下调，具有明显差异，见图 6-C。CIBERSORT免疫细胞浸润分析得出免疫细胞表达柱状图（图6-D），可以观察各样本免疫细胞的组成；得到箱线图（图6-E），可以看出中性粒细胞、激活的肥大细胞、静止肥大细胞、静止树突状细胞、M2巨噬细胞等在实验组和对照组中表达存在差异；得到免疫细胞相关性图（图6-F），可观察到各免疫细胞与其他免疫细胞的正负相关性。同时进行目标基因ANXA5与各免疫细胞间的相关性分析，发现目标基因ANXA5对中性粒细胞、活化肥大细胞等具有正调控作用，对M2巨噬细胞、静止树突状细胞等具有负调控作用，见图6-G；并得出各免疫细胞间关系及与目标基因ANXA5间的调控关系，见图6-H。

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  图6 基因集分析和免疫细胞相关分析

  Figure 6.Gene set analysis and immune cell correlation analysis

  注：A. ANXA5高表达组基因富集分析；B. ANXA5低表达组基因富集分析；C. ANXA5基因集变异分析；D. 免疫细胞表达柱状图；E. 免疫细胞表达箱线图；F. 免疫细胞表达相关性；G. ANXA5与各免疫细胞间相关性；H. ANXA5与各免疫细胞的调控关系。

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2.7 ceRNA调控网络

预测与目标基因表达相关的miRNA为miR-802、miR-335-3p、miR-590-3p，与miRNA表达相关的lncRNA是CTA-414D7.1、SLC8A1-AS1、LINC00240、CTA-392E5.1、AC005614.3、RP11-146D12.2、RP11-335L23.4、RP11-762H8.4、AC006548.28、LINC01122、AC093639.1、RP11-96K19.4、CTD-2561J22.5、LA16c-60D12.2、RP11-638L3.1，并构建ceRNA调控网络，见图7。

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  图7 ceRNA调控网络图

  Figure 7.Diagram of ceRNA regulatory network

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3 讨论

IEC作为肠粘膜屏障的主要成分，其损伤可能在UC发病过程中起决定性作用[6]。IEC包括微折叠M细胞、肠内分泌细胞、肠上皮上吸收细胞、杯状细胞和帕内斯细胞，可对各种类型的免疫细胞作出反应，并调节上皮屏障功能和肠道微生物群[7]。持续和严重的ERS通过IEC中的未折叠蛋白反应引发自噬而导致肠道炎症反应，过量的ERS也会破坏肠道粘膜屏障并最终导致UC[8]。因此，探究UC发病过程中潜在的生物标志物，为治疗过程中提供新的靶点极为重要，对后续临床诊断及治疗UC意义深远。

本研究差异基因GO分析结果显示，ERS相关基因主要参与的生化过程包括对ERS的反应、对ERS反应的调控、ERS反应中的内在凋亡信号通路等，ERS相关基因可能通过这些生化过程参与肠道炎症反应过程。ERS相关基因主要参与的分子组成包括内质网腔、内质网蛋白复合物、内质网伴侣复合体、内吞囊泡等，ERS相关基因主要参与的分子功能为肽结合、抗氧化活动、错误折叠蛋白的结合、酰胺结合、过氧化物酶活动等；ERS是由ER中未折叠和错误折叠蛋白质的积累驱动的[9]，因而ERS相关基因参与的分子组成和功能可能与未折叠和错误折叠蛋白质的生成或降解相关。ERS除了与心肌缺血再灌注损伤、衰老、骨质疏松、肝硬化、肿瘤相关外,还与阿尔兹海默病、糖尿病、感染性疾病、动脉粥样硬化等多种疾病相关[10-11]。本研究KEGG结果中ERS相关基因主要富集条目为脂质与动脉粥样硬化、流体剪切应力与动脉粥样硬化、疟疾、类风湿性关节炎、非酒精性脂肪肝、炎症性肠病、疱疹病毒感染相关卡波西肉瘤、百日咳、麻疹、神经退行性病变等，与既往研究结果一致[12-13]，并为上述疾病治疗提供新的思路。

孟德尔随机化分析结果显示，ANXA5基因表达水平的升高增加了UC的发病风险。来自不同分析平台、不同实验、不同人群的工具变量可能存在异质性而影响随机化分析结果，但本研究异质性检验结果提示不存在异质性，结果较可靠。多效性检验P值大于0.05，表明数据不存在明显多效性。有研究表明，ANXA5为UC的诊断基因，其与免疫浸润密切相关[14]。葡聚糖硫酸钠（DSS）诱导的结肠炎小鼠实验证实，ANXA5的表达主要在肠道巨噬细胞中增加，并与M2巨噬细胞呈强负相关，这表明其可能对UC患者巨噬细胞的极化产生影响[15]。巨噬细胞是一种先天性免疫细胞，大部分来源于单核细胞[16]。单核细胞可能不是巨噬细胞的唯一来源，肠道巨噬细胞来源于肠道内常驻的巨噬细胞。巨噬细胞能分泌细胞因子[17]、清除细胞碎片[18]、杀死病原体[19]，并参与炎症反应[20]、组织修复[21]、血管生成[22]等。肠道炎症发生时，炎症单核细胞迁移至肠道并分化为树突状细胞和炎症巨噬细胞，可产生多种参与炎症反应的细胞因子[23]。炎症巨噬细胞通常被激活为M1表型，而驻留巨噬细胞通常被激活为M2表型。这一过程受多种复杂因素影响，称为极化。巨噬细胞的极化是动态的，在一定条件下可以逆转。极化的巨噬细胞主要由经典的M1途径激活和M2旁路途径激活[24]。在UC活动期，肠壁固有层内的巨噬细胞多为M1表型，M1分解紧密连接蛋白，破坏上皮屏障，诱导上皮细胞凋亡，导致过度炎症[25]，其中M1在肠道炎症中起主要作用，M2起拮抗作用，消除炎症，促进组织愈合。研究证实，增加M2的比例可减轻小鼠的结肠炎症状[26]。而本研究免疫细胞浸润分析得出静止树突状细胞、M2巨噬细胞等在实验组和对照组中表达存在差异；目标基因ANXA5可以负调控M2巨噬细胞、静止树突状细胞等；ANXA5可能通过下调M2巨噬细胞增加UC发病风险。

GSVA结果显示，ANXA5基因高表达组中JAK-STAT通路表达明显上调。促炎细胞因子如白细胞介素-12、白细胞介素-23和白细胞介素-6通过激活JAK-STAT途径，在UC发病机制中发挥关键作用。白细胞介素-12和白细胞介素-23分别通过JAK2和酪氨酸激酶2激活STAT3和STAT4，而白细胞介素-6通过JAK1/2和酪氨酸激酶2激活STAT3，从而加重肠道炎症反应[27-28]。作用于JAK/STAT信号通路的药物已被研发，如托法替尼、培非替尼、巴里西替尼、阿布罗西替尼、依他西替尼、非戈替尼、乌帕西替尼等[29]。与生物制剂不同，这些药物可以口服给药，不具备免疫原性[30]。相关临床试验已着手评估托法替尼、佩非替尼、伊替替尼对活动性UC患者的诱导和维持治疗效果[31-33]，本研究也为JAK/STAT通路抑制剂治疗UC提供了理论依据。

早期诊断UC可更精准地进行药物治疗并预防并发症，目前结肠镜检查是诊断UC的金标准，然而，结肠镜检查具有侵入性，给患者带来较大的身体和经济负担，并伴有肠穿孔和死亡等严重并发症[34-35]。研究发现，miRNA在细胞外以微泡、外泌体或凋亡小泡的形式存在，具有较高的稳定性，有望成为UC新的诊断标志物[36]。现已发现一些miRNA能够调控UC的致癌作用，如miRNA-301a通过靶向SNIP1和BTG1促进Th17分化，降低cadherin-1表达，破坏肠道屏障功能；而敲除miRNA-301a可减轻炎症，抑制肿瘤发生 [37]。本研究中预测与目标基因ANXA5表达相关的miRNA可能成为UC诊断的标志物，或作为UC治疗的靶点，对UC未来的诊断和治疗提供新的思路。

本研究利用生物信息学方法对溃疡性结肠炎ERS相关基因及其调控的免疫细胞进行分析，预测了ERS相关基因ANXA5增加UC发病风险，筛选出的miRNA、lncRNA或可作为UC的生物标志物，为UC的诊断、治疗干预手段提供新思路。由于数据选择和分析技术的局限性，未来有待实验进一步验证所预测基因和通路的正确性。

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