目的  探究SCG5在舌鳞状细胞癌（tongue squamous cell carcinoma，TSCC）中的表达情况及其对TSCC细胞增殖、侵袭和迁移能力的影响。

方法  通过公共数据库评估SCG5在临床患者中的表达情况及其与预后的相关性；构建SCG5稳定敲低和过表达的TSCC细胞模型，采用细胞计数试剂盒-8（cell counting kit-8，CCK-8）、平板克隆、Transwell和划痕实验评估TSCC细胞的增殖、侵袭和迁移能力。利用实时荧光定量聚合酶链反应、Western blot检测TSCC细胞系中SCG5及上皮间充质转化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）相关蛋白的表达情况。利用基因富集分析筛选SCG5的靶基因CYP450，采用基因相关性分析进一步验证两者之间的关系，随后通过Western blot检测SCG5下调后CYP450家族相关基因的表达情况。

结果  SCG5在头颈部鳞状细胞癌（head and neck squamous cell carcinoma，HNSCC）组织中高表达，且与不良临床预后显著相关。下调SCG5表达抑制了TSCC细胞的增殖、侵袭和迁移能力及EMT过程；相反，过表达SCG5则增强了TSCC细胞的增殖和侵袭能力。基因富集分析结果显示，SCG5与药物代谢CYP450通路显著相关；基因相关性分析表明，CYP4F3与SCG5表达呈负相关。Western blot检测发现CYP450家族相关基因在SCG5基因敲低后表达增加。

结论  SCG5在HNSCC组织及TSCC细胞中高表达，下调SCG5可显著抑制TSCC细胞的增殖、侵袭、迁移和EMT过程，而SCG5过表达则会增强这些恶性行为。SCG5与CYP450的互作关系可能在TSCC的发展中发挥重要作用。

舌鳞状细胞癌（tongue squamous cell carcinoma，TSCC）是口腔颌面部最高发的恶性肿瘤，作为头颈部鳞状细胞癌（head and neck squamous cell carcinoma，HNSCC）主要的亚型之一，其发病率逐年升高[1-2]。由于舌部丰富的血液供应和淋巴引流，舌癌具有较强的侵袭性和转移性，尤其是向颈部淋巴结转移，恶性程度较高。美国癌症协会2019年更新的数据显示，舌癌的五年生存率为66%左右[3]。因此，寻找新的生物标志物，开发新的靶向治疗方法对于改善TSCC患者的临床预后意义重大。

SCG5是分泌颗粒蛋白和嗜铬颗粒蛋白家族的成员，SCG5基因的蛋白产物与多种神经内分泌功能有关，主要在神经系统和内分泌细胞中表达[4-5]。近年来，SCG5基因在癌症研究中的作用逐渐被重视，且已被证明在一系列恶性肿瘤的发生和发展中发挥重要作用。有研究表明，SCG5可能被用作胰腺腺癌的诊断和预后标志物 [6]。然而，其在TSCC中的作用和机制尚不明确。CYP450家族由一系列参与药物氧化代谢的酶亚家族组成，在药物激活和消除中起核心作用[7]。CYP450介导的抗癌药物活化可能是耐药的机制之一。有研究表明，环磷酰胺和异环磷酰胺经CYP酶生物活化为烷基化抗癌药物，从而发挥抗癌活性[8-9]。但目前鲜有系统性研究探讨SCG5和CYP450之间的关系。

本研究通过公共数据库评估SCG5在HNSCC中的表达情况及其与预后的相关性，建立SCG5稳定敲低及过表达的TSCC细胞系，并通过一系列功能实验探究其对TSCC细胞的影响。同时，通过生信分析筛选其靶基因CYP450，并利用Western blot进行验证，以此揭示SCG5在TSCC中的作用。

1 资料与方法

1.1 主要材料

舌癌细胞系CAL27及SCC9购自武汉普诺塞生物有限公司；高糖DMEM培养基购自武汉塞维尔生物科技有限公司；胎牛血清（foetal bovine serum，FBS）、0.25%胰酶、细胞冻存液购自武汉汇宇诚生物科技有限公司；慢病毒沉默及过表达质粒均购自上海吉凯基因公司；SCG5、GAPDH、E-钙粘蛋白、N-钙粘蛋白、波形蛋白抗体和二抗购自武汉三鹰生物技术有限公司；CYP4F3、CYP2C19、CYP4B1抗体购自艾比玛特医药科技有限公司；细胞计数试剂盒-8（cell counting kit-8，CCK-8）、RNA逆转录试剂盒、实时荧光定量聚合酶链反应（real time quantitative polymerase chain reaction，

RT-qPCR）SYBR Green qPCR试剂盒、RNA提取试剂盒TRIzol购自南京诺唯赞生物科技有限公司；GAPDH和SCG5引物购自北京擎科生物科技股份有限公司；BCA蛋白测定试剂盒和ECL化学发光试剂盒购自美国Thermo Fisher公司；Transwell小室及Matrigel基质胶购自美国Corning公司；荧光定量PCR仪、凝胶成像分析器购自美国Bio-Rad公司；荧光倒置显微镜购自日本OLYMPUS公司。

1.2 方法

1.2.1 生物信息学分析

SCG5在不同癌症中的mRNA表达水平数据来源于TIMER网站（http://timer.comp-genomics.org）。由于TSCC是HNSCC的一个亚型，二者在分子机制和病理特征上具有较高的相似性，因此，在缺乏专门针对TSCC的大规模公共数据集的情况下，本研究选择癌症基因组图谱数据库（The Cancer Genome Atlas，TCGA）的HNSC数据集进行分析，以探索SCG5在TSCC中的潜在作用。HNSCC和相邻正常组织的转录组数据来自TCGA-HNSC（https://portal.gdc.cancer.gov/）和GTEx（https://www.gtexportal.org/home/）数据库。SCG5在HNSCC和正常组织中的mRNA表达使用R 4.3.3软件进行分析。HNSCC与SCG5的临床相关性分析来自UALCAN（https://ualcan.path.uab.edu/analysis.html）。总生存期分析在GEPIA2（http://gepia2.cancer-pku.cn/）中进行。基于TCGA-HNSC数据集的HNSCC转录组数据，使用R 4.3.1软件进行基因集富集分析（Gene Set Enrichment Analysis，GSEA）和京都基因与基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）分析。

1.2.2 细胞培养

细胞培养使用DMEM培养基，并加入10% 胎牛血清（fetal bovine serum，FBS），在37 ℃、5% CO₂的培养条件下培养。每当细胞生长至85%的汇合度时，进行传代培养和接种。所有细胞在培养过程中均定期检查，确保其形态和生长状态正常。在进行实验前，细胞均经过至少3次传代，以确保实验结果的可靠性。

1.2.3 细胞转染

收集对数生长期的细胞，并与慢病毒载体和病毒感染因子一起在37 ℃、5% CO₂的条件下孵育。慢病毒转染48 h后，加入2 µg/mL的嘌呤霉素，并筛选24~48 h。转染效率通过 Western blot和RT-qPCR分析进行评估。所有转染实验均重复三次，以确保实验结果的可重复性。

1.2.4 实时荧光定量聚合酶链反应

利用TRIzol Reagent从TSCC细胞中提取总RNA。RNA的质量和浓度通过NanoDrop 3300分光光度计进行测量，使用逆转录酶进行逆转录。RT-qPCR反应在CFX96 Connect上进行，根据SYBR Green PCR试剂盒使用说明，在95 ℃下反应30 s，随后在95 ℃反应15 s，60 ℃反应30 s。以GAPDH为内参。每个样本至少进行三次重复实验，所得数据采用2-ΔΔCt方法进行分析。所用引物如下：

SCG5：

正向：5'-GGTACCCAGACCCTCCAAAT-3'

反向：5'-TCGTCTCTCTCCTCCCTTCA-3'

GAPDH：

正向：5'-GGAGTCCACTGGCGTCTTCA-3'

反向：5'-GTCATGAGTCCTTCCACGATACC-3'

1.2.5 Western blot

使用含有磷酸酶和蛋白酶抑制剂的RIPA裂解缓冲液提取细胞总蛋白。蛋白浓度通过BCA试剂盒进行测定，并加热处理。等量上样后进行SDS-PAGE电泳分离，随后转膜到PVDF膜上。所有膜在5%脱脂奶粉中封闭1 h，然后在4 ℃下与一抗孵育过夜。第二天用TBST洗膜后，膜在室温下与辣根过氧化物酶标记的二抗孵育1 h。再次用TBST洗膜，使用增强化学发光液（enhanced chemiluminescence，ECL）检测试剂盒显现蛋白条带。相对蛋白水平通过ImageJ软件分析。对于每组样本均测量并分析至少3个生物学重复，以确保数据的可重复性和可靠性。

1.2.6 CCK-8实验

将细胞以5×10³细胞/孔的密度接种到96 孔板中，每孔加入100 µL含10% FBS的DMEM培养基，置于37 ℃、5% CO₂的条件下培养。在指定时间后，向每孔中加入10 µL CCK-8溶液，并在37 ℃下孵育1 h。使用酶标仪测量各孔在450  nm处的吸光度。根据结果绘制细胞生长曲线，每组设置5个复孔。

1.2.7 平板克隆实验

以1 000细胞/孔的密度将细胞接种到6孔板中，并在37 ℃、5% CO₂的条件下，在含10% FBS的DMEM培养基中培养10~14 d，每3 d更换一次培养基。当细胞集落固定并肉眼可见时，用4%多聚甲醛固定15 min，并用0.1%结晶紫染液染色15 min。通过ImageJ对含有超过50个细胞的集落计数。所有实验均重复三次。

1.2.8 划痕实验

将细胞接种在6孔板中，当细胞生长至90%~100%的汇合度时，使用无菌的200 µL移液管吸头在细胞单层上划出划痕。使用磷酸盐缓冲液（phosphate buffer solution，PBS）洗去脱落的细胞，细胞用不含血清的培养基培养。使用100倍倒置显微镜在0、24、48 h后拍摄划痕区域的图像。划痕迁移率通过ImageJ 计算，表示为划痕面积随时间减少的百分比。所有实验均重复三次。

1.2.9 Transwell侵袭实验

先将带有8 µm孔径的Transwell小室在37 ℃、5% CO₂条件下用Matrigel基质胶预处理3 h。然后将细胞以2.5×10⁵细胞/mL的密度重悬于无血清培养基中，取200 µL细胞悬液加入上室。下室加入含10% FBS的培养基。在37  ℃、5% CO₂条件下培养48 h后，取出小室，用4%多聚甲醛固定，并用0.1%结晶紫染液染色30 min，用棉签擦去上室底部未穿过的细胞。倒置显微镜下随机挑选5个视野拍照并记录穿膜细胞数。

1.3 统计学方法

采用GraphPad Prism 9.5软件进行绘图和统计分析。所有实验均重复3次，正态分布的定量资料以均数和标准差（）表示，偏态分布的以中位数和四分位数间距[M（P₂₅，P₇₅）]表示。满足正态分布且满足方差齐性的定量资料采用独立样本t检验和方差分析；满足正态分布但不满足方差齐性检验的定量资料采用Welch one-way ANOVA检验；不满足正态分布的定量资料采用Mann-Whitney U和Kruskal-Wallis检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 SCG5在头颈部鳞状细胞癌中高表达

基于TCGA-HNSC数据集的泛癌症分析结果显示，与正常组织相比，SCG5在各种肿瘤组织中均有差异表达，且在HNSCC中显著过表达（图 1-A）。TCGA-HNSC数据集的520个HNSCC组织和44个邻近正常组织的mRNA水平表明，HNSCC组织中的SCG5 mRNA水平显著高于邻近正常组织（图 1-B）。同时，配对样本分析显示了86对HNSCC组织和癌旁组织中SCG5的转录水平，SCG5 mRNA水平在HNSCC样本中仍然升高（图1-C）。

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  图1 SCG5在头颈部鳞状细胞癌中高表达

  Figure 1.The high expression of SCG5 in head and neck squamous cell carcinoma

  注：A. TCGA-HNSC数据集中SCG5 mRNA在不同肿瘤中的表达水平；B. TCGA-HNSC数据集中头颈部鳞状细胞癌组织和正常组织中SCG5的mRNA表达水平；C. TCGA-HNSC数据集中SCG5在头颈部鳞状细胞癌组织和癌旁组织中的mRNA表达水平。*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。

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2.2 SCG5与不良临床预后相关

UALCAN收集的临床数据分析结果显示，SCG5过表达与肿瘤分期、分级和淋巴结转移呈正相关（图2-A至图2-C）。此外，来自TCGA-HNSC的518例HNSCC样本的Kaplan-Meier生存分析显示，与低表达组相比，SCG5高表达组的总生存期较短（图2-D）。

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  图2 SCG5与不良临床预后的相关性

  Figure 2.Correlation of SCG5 with the poor clinical prognosis

  注：A~C. UALCAN数据库头颈部鳞状细胞癌中SCG5表达水平与临床分期、分级和淋巴结转移的相关性；D. SCG5高表达组和低表达组头颈部鳞状细胞癌的总生存曲线。*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。

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2.3 下调SCG5抑制舌鳞状细胞癌细胞的上皮间充质转化过程

利用shRNA序列构建稳定的SCG5敲低人TSCC细胞系（CAL27和SCC9）。Western blot和RT-qPCR证实了其敲除效率。作为肿瘤转移、胚胎发生和纤维化的关键过程，上皮间充质转化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）及其标志物在TSCC细胞中的表达随着SCG5的下调而改变。与阴性对照组相比，SCG5基因敲低可下调N-钙粘蛋白和波形蛋白的表达，上调E-钙粘蛋白的表达（图3-A、图3-B）。

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  图3 下调SCG5抑制舌鳞状细胞癌的上皮间充质转化过程

  Figure 3.Downregulation of SCG5 inhibits the epithelial-mesenchymal transition process of tongue squamous cell carcinoma

  注：A. Western blot分析显示SCG5、E-钙粘蛋白、波形蛋白和N-钙粘蛋白的表达情况及量化分析；B. SCG5 mRNA表达水平的RT-qPCR分析。**P<0.01，***P<0.001。

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2.4 下调SCG5抑制舌鳞状细胞癌细胞的增殖能力

CCK-8实验显示，与对照组相比，SCG5敲低组细胞增殖能力显著下降（图4-A）。同样地，平板克隆结果显示，与对照组相比，SCG5敲低组细胞的集落数量明显减少（图4-B）。

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  图4 下调SCG5抑制舌鳞状细胞癌细胞的增殖能力

  Figure 4.Downregulation of SCG5 inhibits the proliferation ability of tongue squamous cell carcinoma cells

  注：A. CCK-8实验检测SCG5敲低后舌鳞状细胞癌细胞的增殖能力；B. 平板克隆实验检测SCG5敲低后舌鳞状细胞癌细胞的增殖能力。**P<0.01，***P<0.001。

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2.5 下调SCG5抑制舌鳞状细胞癌细胞的侵袭和迁移能力

划痕实验结果显示，与对照组相比，SCG5敲低组细胞在24和48 h的迁移率明显下降（图 5-A）。同时，Transwell实验结果显示出相同的趋势，SCG5敲低组穿透细胞数显著减少（图 5-B）。

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  图5 下调SCG5抑制舌鳞状细胞癌细胞的侵袭和迁移能力

  Figure 5.Downregulation of SCG5 inhibits the invasion and migration ability of tongue squamous cell carcinoma cells

  注：A. 划痕实验检测SCG5敲低后舌鳞状细胞癌细胞的迁移能力；B. Transwell实验检测SCG5敲低后舌鳞状细胞癌细胞的侵袭能力。*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。

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2.6 过表达SCG5增强舌鳞状细胞癌细胞的增殖和侵袭能力

为了进一步验证SCG5在TSCC细胞中的作用，利用慢病毒载体构建稳定的过表达SCG5的TSCC细胞系，并用嘌呤霉素筛选阳性克隆。通过Western blot分析证实了SCG5的过表达效率（图 6-A）。Transwell和CCK-8实验显示，SCG5过表达增强了TSCC细胞的增殖和侵袭能力（图 6-B、图6-C）。

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  图6 过表达SCG5增强舌鳞状细胞癌细胞的增殖和侵袭能力

  Figure 6.Overexpression of SCG5 enhances the proliferation and invasion of tongue squamous cell carcinoma cells

  注：A. Western blot检测转染后，舌鳞状细胞癌细胞中SCG5的表达量及量化分析；B. Transwell实验检测SCG5过表达后舌鳞状细胞癌细胞的侵袭能力；C. CCK-8实验检测SCG5敲低后舌鳞状细胞癌细胞的增殖能力。***P<0.001。

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2.7 下调SCG5抑制CYP450相关基因的表达

为了阐明SCG5促进TSCC进展的潜在机制，利用KEGG和GSEA进行通路富集分析，结果显示，与药物代谢相关的CYP450通路显著富集（图 7-A）。基因相关性分析进一步显示，CYP450家族成员CYP4F3与SCG5的表达呈显著负相关（图7-B）。通过Western blot进行验证，发现CYP450相关基因在SCG5敲低细胞中表达增加（图7-C），表明SCG5可能通过CYP450发挥促癌作用。

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  图7 下调SCG5抑制CYP450相关基因的表达

  Figure 7.Downregulation of SCG5 inhibits the expression of CYP450-related genes

  注：A. SCG5高表达组和低表达组的京都基因与基因组百科全书分析及基因集富集分析；B. TCGA-HNSC数据集中SCG5与CYP4F3的基因相关性分析；C. Western blot检测CYP450家族相关基因的表达及其量化分析。***P<0.001。

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3 讨论

本研究揭示了SCG5参与TSCC发生和发展的机制，以及其对EMT和药物代谢CYP450相关基因的调控作用。通过网络公共数据库分析发现，SCG5在HNCSS中高表达并且与不良的临床预后相关。利用慢病毒构建了稳定敲低及过表达SCG5的TSCC细胞模型；通过CCK-8、平板克隆、Transwell和划痕实验发现，SCG5能够通过促进TSCC细胞的增殖、侵袭和迁移能力，进而促进TSCC的发生和进展。

SCG5位于染色体15q11-q15区域上，是一种编码分泌颗粒蛋白的基因，属于分泌颗粒蛋白家族的一部分[5, 10]。SCG5基因的蛋白产物与多种内分泌和神经内分泌功能有关，主要在神经系统和内分泌细胞中表达[11]。既往关于SCG5的研究主要探讨其在神经退行性疾病和代谢性疾病中的作用，然而近年来，关于它在肿瘤相关领域的研究越来越多 [12-14]。最近的一项研究发现，SCG5在食管鳞癌的发生发展中发挥关键作用[4]；Jo等则指出SCG5是与脂肪减少相关的胰腺腺癌的循环诊断生物标志物[15]。

通过生信分析和Western blot验证发现，伴随着SCG5的下调，EMT和CYP450相关蛋白的表达被显著抑制。EMT是细胞在形态、功能和行为上发生显著变化的过程，通常表现为上皮细胞向间充质细胞的转化。此过程不仅在胚胎发育、组织修复和纤维化中扮演着关键角色，也在肿瘤的发生发展中起着至关重要的作用[16-18]。CYP450是一类存在于多种生物体内的重要酶家族，广泛参与代谢过程。近年来，越来越多的研究发现其在抗癌药物中发挥的重要作用[8-9]。

综上，SCG5可通过促进EMT过程进而促进TSCC的恶性程度。此外，它还可能通过调控CYP450相关蛋白的表达从而影响TSCC细胞对抗癌药物的反应。本研究为探索TSCC发生发展的相关机制提供了新的线索，并为未来研究SCG5在TSCC中的潜在作用奠定了基础。本研究尚存在一定的局限性，仅局限于体外细胞实验，缺乏动物模型和临床样本的功能验证。未来需进一步开展体内实验及临床研究以验证SCG5作为TSCC预后标志物及治疗靶点的潜力；关于SCG5调控EMT及CYP450相关基因表达的潜在机制也是未来研究的重点。

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