目的  探讨肉苁蓉苯乙醇总苷（Cistanche phenylethanol glycosides，CPhGs）对耐药骨肉瘤荷瘤小鼠固有免疫功能、肿瘤生长及肿瘤细胞凋亡的影响机制。

方法  通过梯度浓度法建立人骨肉瘤MG-63细胞耐药株，并构建耐药骨肉瘤荷瘤裸鼠模型（共36只，每组6只）。模型组予以生理盐水灌胃；甲氨蝶呤（methotrexate，MTX）组每三日腹腔注射MTX（20 mg/kg）；联合组每三日腹腔注射MTX的同时给予中剂量浓度CPhGs（250 mg/kg）每日灌胃；CPhGs高、中、低剂量组分别给予高（500 mg/kg）、中（250 mg/kg）、低（125 mg/kg）剂量浓度的CPhGs每日灌胃。观察裸鼠骨肉瘤瘤体大小变化，绘制各组肿瘤平均体积随时间变化曲线图，计算抑瘤率；采用ELISA法检测裸鼠血清中IL-2、TNF-α含量；利用流式细胞术检测肿瘤组织细胞凋亡的情况；Western blot检测肿瘤组织中凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax表达及p-AKT、p-mTOR、p-PI3K表达变化。

结果  与模型组相比，各实验组肿瘤组织体积及重量显著减小（P＜0.001）；与模型组和MTX组相比，各CPhGs组、联合组裸鼠血清IL-2、TNF-α含量显著升高（P＜0.01）；与模型组相比，各实验组Bax表达显著升高（P＜0.001），高、中剂量CPhGs组及联合组Bcl-2表达显著降低（P＜0.001）；与模型组和MTX组相比，各CPhGs组及联合组裸鼠瘤体组织凋亡率均显著升高，且p-AKT、p-mTOR、p-PI3K含量显著减少（P＜0.05）。

结论  CPhGs能显著改善耐药骨肉瘤荷瘤裸鼠的免疫功能，并通过调控PI3K/AKT/mTOR信号通路及Bax、Bcl-2凋亡蛋白的表达促进肿瘤细胞凋亡，从而有效抑制肿瘤生长。

骨肉瘤（osteosacoma，OS）是一种高度恶性原发性骨肿瘤，其发病率在青少年原发性恶性骨肿瘤中居首位，具有极高的致残率和致死率。目前，术后应用大剂量甲氨蝶呤（methotrexate，MTX）单药或联合其他化疗药物，可有效提高OS患者的生存率[1]。然而，部分OS患者因耐药对化疗不敏感，导致肿瘤进展。此外，肿瘤患者体内T淋巴细胞亚群常处于免疫失衡状态，化疗会在短期内进一步加重免疫紊乱及免疫抑制 [2]。有研究表明，从OS的生物学特征层面分析，增强人体免疫反应可能改善OS患者的预后[3]。化疗耐药是OS患者治疗失败最常见且最难解决的问题之一，免疫功能低下也是导致肿瘤快速进展的关键因素之一[4]。

磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）/蛋白激酶B（AKT）/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）信号通路被认为是人类癌症中最重要的致癌通路之一。该通路在OS中常过度激活，可驱动OS细胞增殖、侵袭、转移及血管生成，并抑制其凋亡，进而导致OS对化疗药物的耐药性[5]。研究证实，肉苁蓉主要成分肉苁蓉苯乙醇总苷（Cistanche phenylethanol glycosides，CPhGs）可增强肝癌荷瘤小鼠的免疫功能，抑制肿瘤生长[6]。体外研究表明，CPhGs能显著抑制肝癌细胞HepG2的增殖，并诱导其凋亡[7]。诱导细胞凋亡是目前抗肿瘤药物的主要作用机制，也是近年来OS治疗的研究热点之一。裸鼠在解剖生理学、生物学等方面与人有较多相似之处，且裸鼠对移植瘤的接受性较强，可以移植某些异源肿瘤细胞，在肿瘤模型建立中应用范围较广[8-9]。本研究拟通过构建耐药骨肉瘤荷瘤裸鼠模型，观察CPhGs对耐药骨肉瘤荷瘤裸鼠模型免疫功能、PI3K/AKT/mTOR通路的影响及其对肿瘤生长的抑制作用和药理学机制，以期为拓宽OS的临床治疗思路和基础研究提供参考。

1 资料与方法

1.1 实验动物

SPF级裸鼠36只（6~8周龄，体重19~25 g），购自常州卡文斯实验动物有限公司，动物合格证号：NO.202367524。本实验经西北民族大学实验动物伦理委员会批准（Xbmu-3m-202306）。

1.2 细胞株

MG-63细胞，购自上海中科院细胞研究所。

1.3 药品与试剂

胎牛血清、高糖DMEM培养基、0.25% Trypsin-EDTA、MTX（大连美仑生物技术有限公司，批号分别为PWL001、MA0212、MA0233-1、MB1156-1）；CPhGs（陕西森元生物科技有限公司，批号：SY20231212605）；p-mTOR抗体、p-PI3K抗体、p-AKT抗体、Bcl-2抗体、Bax抗体（杭州华安生物技术有限公司，批号分别为HA600094、HA721673、ET1607-73、ET1702-53、ET1603-34）；TNF-α、IL-2的ELISA检测试剂盒（杭州联科生物技术有限公司，批号分别为EK282、EK202）。

1.4 仪器

CT14RD台式高速冷冻离心机（上海天美生化仪器有限公司）；SW-CJ-1 FD超净台（苏州净化股份有限公司）；CO-5AC细胞培育箱（日本三洋电机公司）；AE31荧光倒置显微镜（厦门麦克奥迪实业集团有限公司）；RT-6100酶标仪（深圳雷杜生命科学股份有限公司）；PowerPoc凝胶电泳仪、ChemiDocTM凝胶成像分析仪（美国Bio-rad公司）。

1.5 实验方法

1.5.1 建立人骨肉瘤MG-63耐药株（MG-63/MTX）

培养MG-63细胞至对数生长期，细胞融合率达到80%。加入预先配制好的含100 ng/mL MTX的细胞培养液，48 h后换液，待细胞重新达到80%融合率后，继续加入含相同浓度MTX的培养液。重复上述步骤，使MG-63骨肉瘤细胞能在含100 ng/mL MTX的培养液中稳定生长。接着按照此法逐渐提高培养液中MTX的浓度，依次采用200 ng/mL、500 ng/mL、1 000 ng/mL、2 000 ng/mL、5 000 ng/mL及10 000 ng/mL的浓度。经过5个月的培养，最后选取10 000 ng/mL MTX中稳定生长的骨肉瘤耐药系（MG-63/MTX）进行后续实验。

1.5.2 构建耐药骨肉瘤荷瘤裸鼠动物模型

骨肉瘤动物模型造模方法参考文献[10]，将MG-63/MTX细胞制备成浓度为4×10⁶/100 μL细胞悬液，于裸鼠腋窝皮下注射100 μL造模，观察成瘤情况。

1.5.3 动物分组与干预

将荷瘤模型裸鼠随机分为模型（Model）组、MTX组、MTX联合CPhGs（MTX-CPhGs）组、高剂量CPhGs（CPhGs-H）组、中剂量CPhGs（CPhGs-M）组和低剂量CPhGs（CPhGs-L）组，每组6只。造模后第6天开始灌胃，模型组小鼠每日灌胃10 μL/g 生理盐水；MTX组腹腔注射20 mg/kg MTX，每三天注射一次；MTX-CPhGs组每日灌胃250 mg/kg CPhGs，同时腹腔注射20mg/kg MTX，每三天注射一次；CPhGs-H组每日灌胃500 mg/kg CPhGs；CPhGs-M组每日灌胃250 mg/kg CPhGs；CPhGs-L组每日灌胃125 mg/kg CPhGs。各组裸鼠均连续处理15天。

1.5.4 测定耐药骨肉瘤荷瘤裸鼠肿瘤体积及重量

观察并记录各组裸鼠的肿瘤体积，并绘制肿瘤生长曲线。末次给药24 h后，采用颈椎脱臼法处死小鼠，剥离肿瘤并称重，计算抑瘤率。抑瘤率计算方式如下：

瘤体体积=1/2（肿瘤长径×肿瘤短径2）

抑瘤率=[（模型组平均瘤重－给药组平均瘤重）/模型组平均瘤重]×100%

1.5.5 ELISA检测血清IL-2、TNF-α含量

提取各组裸鼠血清，利用ELISA法检测小鼠血清IL-2与TNF-α的含量，具体操作按ELISA试剂盒说明书进行。

1.5.6 流式细胞术检测肿瘤组织细胞凋亡情况

取各组裸鼠肿瘤组织剪碎、研磨、过滤、离心、裂解红细胞，制备为单细胞悬液置于离心管。并调整细胞浓度至1×10⁶/mL，100 μL的Binding Buffer重悬细胞，加入5 μL的AV-FITC和PI，避光孵育15 min，离心重悬后加入400 μL Binding Buffer，振荡混匀后上机检测。

1.5.7 Western blot检测p-AKT、p-mTOR、p-PI3K及凋亡蛋白Bcl-2、Bax表达

将各组肿瘤组织块剪碎后置于匀浆器中，加入蛋白裂解液裂解匀浆，裂解后在12 000 r/min条件下离心并提取上清。制备电泳凝胶，电泳分离蛋白质，转膜和封闭。一抗4℃孵育过夜，洗膜后用二抗室温孵育1 h。TBST缓冲液摇床洗涤，加入ECL发光溶液显影，定影后进行凝胶图像分析，并用Image J软件分析蛋白条带灰度值。

1.6 统计分析

采用GraphPad Prism 7和SPSS 25.0软件进行统计分析。计量资料以均数和标准差（）表示，符合正态分布且方差齐者，组间比较采用单因素方差分析（one-way ANOVA），不符合正态分布采用非参数检验。采用配对t检验分析抑瘤率。P ＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 骨肉瘤MG-63耐药系（MG-63/MTX）细胞株

原始MG-63细胞贴壁生长，体积中等，多呈梭形，偶见不规则形，核大，核仁清晰（图1-A）。MG-63/MTX细胞体积变长，呈梭形或不规则形，有明显伪足（图1-B）。

• 
  图1 MG-63与MG-63/MTX细胞形态对比图（×200）

  Figure 1.Morphological comparison of MG-63 and MG-63/MTX cells (×200)

  注：A. MG-63细胞；B. MG-63/MTX细胞。

  

2.2 各组小鼠肿瘤生长情况比较

从灌胃第6天开始，给药组小鼠肿瘤体积与模型组相比明显缩小。灌胃第21天，各组取其中3只裸鼠的肿瘤作比较（图2-A），各给药组瘤体体积与模型组相比均减小（P＜0.001）。CPhGs-H组、CPhGs-M组、CPhGs-L组及MTX-CPhGs组的肿瘤体积均小于MTX组（P＜0.001）。在CPhGs各组中，随着药物浓度的增加，肿瘤体积逐渐减小，与模型组肿瘤体积的差异也越大（图2-B）。表明CPhGs可明显抑制耐药荷瘤小鼠肿瘤组织的生长，且抑制作用与CPhGs浓度呈正相关关系。

• 
  图2 干预后各组荷瘤裸鼠肿瘤体积对比（x ± s，n=3，mm3）

  Figure 2.Comparison of tumor volumes in nude mice with tumors in each group after intervention (x ± s, n=3, mm3)

  注：Model，模型组；MTX，甲氨蝶呤组；CPhGs-L，低剂量肉苁蓉苯乙醇总苷组；CPhGs-M，中剂量肉苁蓉苯乙醇总苷组；CPhGs-H，高剂量肉苁蓉苯乙醇总苷组；MTX-CPhGs，甲氨蝶呤联合肉苁蓉苯乙醇总苷组；与模型（Model）组相比，***P＜0.001；与甲氨蝶呤（MTX）组相比，###P＜0.001。

  

与模型组比较，MTX组、CPhGs-H组、CPhGs-M组、CPhGs-L组及MTX-CPhGs组平均瘤重均显著降低（P＜0. 001）。与MTX组相比，CPhGs-H组、CPhGs-M组、CPhGs-L组及MTX-CPhGs组抑瘤率显著增高，且在CPhGs-H组、CPhGs-M组、CPhGs-L组中，抑瘤率随药物浓度增加呈剂量依赖性升高，详见表1。

• 
  表格1 肉苁蓉苯乙醇总苷对各组荷瘤裸鼠肿瘤重量的影响（n=3）

  Table 1.Effect of Cistanche phenylethanol glycosides on tumor weight in tumor-bearing nude mice ineach group (n=3)

  注：Model，模型组；MTX，甲氨蝶呤组；CPhGs-L，低剂量肉苁蓉苯乙醇总苷组；CPhGs-M，中剂量肉苁蓉苯乙醇总苷组；CPhGs-H，高剂量肉苁蓉苯乙醇总苷组；MTX-CPhGs，甲氨蝶呤联合肉苁蓉苯乙醇总苷组；与模型（Model）组相比，***P＜0.001；与甲氨蝶呤（MTX）组相比，###P＜0.001。

  

2.3 CPhGs对耐药荷瘤裸鼠血清IL-2、TNF-α含量的影响

与模型组比较，MTX组模型小鼠血清TNF-α含量显著增高（P＜0.05），MTX-CPhGs组模型小鼠血清TNF-α和IL-2含量明显增高（P ＜0.01）。此外，CPhGs-H组、CPhGs-M组与CPhGs-L组模型小鼠血清TNF-α含量较模型组均显著增高（P ＜0.001），且CPhGs-M组模型小鼠血清IL-2含量增高（P ＜0.01），而CPhGs-H组和CPhGs-L组模型小鼠血清IL-2含量增高更为显著（P ＜0.001）。与MTX组比较，CPhGs-H组、CPhGs-M组、CPhGs-L组及MTX-CPhGs组小鼠血清TNF-α、IL-2含量均显著增高（P ＜0.001），详见表2。这表明CPhGs可能通过调控TNF-α和IL-2表达水平改善耐药OS荷瘤小鼠固有免疫功能。

• 
  表格2 各组血清TNF-α、IL-2表达水平（n=3）

  Table 2.Serum TNF-α and IL-2 expression levels in each group (n=3)

  注：Model，模型组；MTX，甲氨蝶呤组；CPhGs-L，低剂量肉苁蓉苯乙醇总苷组；CPhGs-M，中剂量肉苁蓉苯乙醇总苷组；CPhGs-H，高剂量肉苁蓉苯乙醇总苷组；MTX-CPhGs，甲氨蝶呤联合肉苁蓉苯乙醇总苷组；与模型（Model）组相比，*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001；与甲氨蝶呤（MTX）组相比，###P＜0.001。

  

2.4 CPhGs对耐药荷瘤裸鼠肿瘤组织细胞凋亡的影响

相较于模型组，MTX组和CPhGs-L组肿瘤组织凋亡率显著升高（P＜0.05），CPhGs-H组、CPhGs-M组及MTX-CPhGs组肿瘤组织凋亡率均升高更为显著（P＜0.001）。相较于MTX组，CPhGs-H组、CPhGs-M组及MTX-CPhGs组肿瘤组织凋亡率均升高（P＜0.001），详见图3、表3。以上表明CPhGs可促进耐药荷瘤裸鼠肿瘤组织细胞的凋亡。

• 
  图3 各组小鼠肿瘤组织细胞凋亡率（n=3，%）

  Figure 3.The apoptosis rate of tumor tissue cells in each group of mice (n=3, %)

  注：A. 模型（Model）组；B. 甲氨蝶呤（MTX）组；C. 甲氨蝶呤联合肉苁蓉苯乙醇总苷（MTX-CPhGs）组；D. 高剂量肉苁蓉苯乙醇总苷（CPhGs-H）组；E. 中剂量肉苁蓉苯乙醇总苷（CPhGs-M）组；F. 低剂量肉苁蓉苯乙醇总苷（CPhGs-L）组。

  

• 
  表格3 各组肿瘤组织细胞凋亡率（n=3）

  Table 3.The apoptosis rate of tumor tissue cells in each group (n=3)

  注：Model，模型组；MTX，甲氨蝶呤组；MTX-CPhGs，甲氨蝶呤联合肉苁蓉苯乙醇总苷组；CPhGs-L，低剂量肉苁蓉苯乙醇总苷组；CPhGs-M，中剂量肉苁蓉苯乙醇总苷组；CPhGs-H，高剂量肉苁蓉苯乙醇总苷组；与模型（Model）组相比，*P＜0.05，**P ＜0.01，***P ＜0.001；与甲氨蝶呤（MTX）组相比，###P＜0.001。

  

2.5 CPhGs对耐药荷瘤裸鼠肿瘤组织p-AKT、p-mTOR、p-PI3K蛋白表达的影响

与模型组相比，MTX组耐药裸鼠肿瘤组织中p-AKT表达水平显著降低（P ＜0.001）。MTX-CPhGs组、CPhGs-H组及CPhGs-M组裸鼠肿瘤组织中p-AKT、p-mTOR、p-PI3K表达水平显著降低（P ＜0.001），CPhGs-L组裸鼠肿瘤组织中p-AKT表达水平降低（P＜0.01），p-mTOR、p-PI3K表达水平降低更为显著（P＜0.001）。与MTX组比较，MTX-CPhGs组及CPhGs-H组裸鼠肿瘤组织中p-AKT、p-mTOR、p-PI3K表达水平亦显著降低（P ＜0.001），CPhGs-M组裸鼠肿瘤组织中p-AKT的表达略有下降（P ＜0.05），p-mTOR、p-PI3K表达水平降低更为显著（P ＜0.001），CPhGs-L组裸鼠肿瘤组织中p-AKT的表达下降（P ＜0.01），p-mTOR、p-PI3K表达水平降低更为显著（P ＜0.001），详见图4-A至图4-D。

• 
  图4 裸鼠肿瘤组织中p-mTOR、p-PI3K、p-AKT、Bcl-2、Bax蛋白电泳结果示意图（x ± s，n=3，mm3）

  Figure 4.Electrophoresis result diagram of p-mTOR, p-PI3K, p-AKT, Bcl-2 and Bax proteins in tumor tissue of nude mice (x ± s , n=3, mm3)

  注：Model，模型组；MTX，甲氨蝶呤组；MTX-CPhGs，甲氨蝶呤联合肉苁蓉苯乙醇总苷组；CPhGs-L，低剂量肉苁蓉苯乙醇总苷组；CPhGs-M，中剂量肉苁蓉苯乙醇总苷组；CPhGs-H，高剂量肉苁蓉苯乙醇总苷组；A. p-mTOR、p-PI3K、p-AKT、Bcl-2和Bax蛋白的Western Blot结果；B. p-mTOR；C. p-PI3K；D. p-AKT；E. Bcl-2；F. Bax；与模型组相比，*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001；与MTX组相比，#P ＜0.05，##P＜0.01，###P＜0.001。

  

2.6 CPhGs对耐药荷瘤裸鼠肿瘤组织Bcl-2、Bax蛋白表达的影响

与模型组相比，各药物组耐药裸鼠肿瘤组织中Bax表达水平均显著增高（P ＜0.001），MTX组肿瘤组织中Bcl-2表达水平增高（P＜0.05），MTX-CPhGs组、CPhGs-H组及CPhGs-M组肿瘤组织Bcl-2表达显著降低（P ＜0.001）。与MTX组比较，CPhGs-H组、CPhGs-M组、CPhGs-L组及MTX-CPhGs组肿瘤组织Bcl-2表达水平均显著降低（P＜0.001），CPhGs-H组与CPhGs-M组肿瘤组织的Bax表达水平显著增高（P＜0.001），详见图4-A、图4-E、图4-F。进一步表明CPhGs可通过调控Bcl-2、Bax表达水平促进耐药荷瘤裸鼠肿瘤组织细胞的凋亡。

3 讨论

OS患者化疗耐药及免疫功能低下是OS临床治疗面临的瓶颈问题。目前，抗肿瘤药物的作用机制主要是促进肿瘤细胞凋亡，该过程是化疗有效性的直接体现；另一方面，机体免疫力是患者耐受化疗药物的有力保障。因此，研究如何有效促进耐药OS细胞凋亡与减少化疗所致的免疫功能损伤至关重要。

肉苁蓉具有温肾填精、润肠、抗氧化、提高免疫力的药理作用。张洪泉等[11]于1988年报道了肉苁蓉水提取物具有改善小鼠免疫能力、激发小鼠免疫功能器官，如胸腺的发育功能；后续的体内研究进一步发现肉苁蓉多糖具有抗肺癌、抗肉瘤的作用[12]。研究发现，肉苁蓉的主要成分CPhGs具有抗氧化、抗衰老、神经保护、提高免疫力、保肝护肝和治疗生精障碍等药理学作用[13]，还对肝癌、肺癌、乳腺癌和卵巢癌等多种恶性肿瘤具有抗肿瘤及促进免疫功能的作用[14]。课题组前期研究发现，肉苁蓉在体外水平可通过降低MRP1及突变型P53蛋白的表达促进耐药OS细胞的凋亡[15]。本研究发现，药物处理组肿瘤体积及重量较模型组相比均减小，不同浓度CPhGs组及MTX-CPhGs组的肿瘤体积较MTX组也有所缩小，抑瘤率随之升高。这表明CPhGs可明显抑制耐药OS荷瘤小鼠肿瘤组织的生长，且抑制作用与CPhGs浓度呈正相关。此结果与候晓甜等[16]的CPhGs抑制H22肝癌小鼠皮下移植瘤生长研究结果基本一致。

免疫功能与肿瘤的发生发展密切相关。IL-2是免疫系统中的一类细胞生长因子，能通过促进T细胞增殖分化提高机体的免疫机能，并产生具有抗肿瘤活性的免疫细胞[17]。TNF-α通过与受体结合诱导肿瘤细胞凋亡、增强宿主免疫功能、作用于肿瘤血管内皮细胞、增加血管通透性、诱发程序性死亡，继而引起肿瘤出血坏死等发挥抗肿瘤作用[18]。通过分析各组小鼠血清IL-2、TNF-α的表达，发现不同浓度CPhGs组、MTX-CPhGs组荷瘤模型小鼠血清TNF-α、IL-2表达水平均显著增高。这提示CPhGs可能通过调控TNF-α、IL-2表达水平改善耐药OS荷瘤小鼠免疫功能，抑制耐药骨肉瘤细胞增殖，进而发挥抗肿瘤作用。

PI3K/AKT/mTOR信号通路中AKT磷酸化可直接或间接调控Bcl-2基因家族、X-连锁凋亡抑制蛋白（XIAP）、鼠双微基因2（MDM- 2）、Bcl-2相关X蛋白（Bax）等一系列凋亡相关因子[19]。异常激活的PI3K/AKT/mTOR信号通路能上调膜转运蛋白ABCB1和ABCC1的表达，从而降低化疗疗效，介导OS细胞对化疗药物耐药性的产生[20]。多种中药单体均可通过抑制PI3K/AKT/mTOR信号通路促进OS细胞凋亡，如原花青素B2、槲皮素、犀草素、松乳菇多糖等[21]。本研究发现，在MTX单独作用下，p-AKT蛋白表达也显著降低，而p-mTOR、p-PI3K蛋白表达未见显著差异，说明MTX对耐药荷瘤裸鼠肿瘤组织中PI3K/AKT/mTOR信号通路影响较小。而不同浓度CPhGs组及MTX-CPhGs组耐药OS荷瘤裸鼠肿瘤组织中p-AKT、p-mTOR、p-PI3K蛋白表达较模型组均降低，相较于MTX组，p-AKT、p-mTOR、p-PI3K蛋白表达也显著降低，揭示了CPhGs对耐药OS细胞的PI3K/ AKT/mTOR信号通路有显著抑制作用。通过流式细胞术检测肿瘤组织的细胞凋亡情况，发现药物干预后各组肿瘤组织凋亡率均显著升高。通过检测Bax、Bcl-2蛋白表达，发现不同浓度CPhGs组及MTX-CPhGs组耐药OS荷瘤裸鼠肿瘤组织中Bax表达水平均显著增高，而MTX-CPhGs组、CPhGs-H组及CPhGs-M组模型小鼠肿瘤组织Bcl-2表达显著降低。这提示一定浓度的CPhGs在体内可能通过抑制PI3K/ AKT/ mTOR信号通路，下调Bcl-2表达并上调Bax表达促进耐药OS细胞的凋亡。

综上，CPhGs在体内可促进抑制耐药OS细胞的凋亡、抑制肿瘤的生长，其机制可能是通过抑制PI3K/AKT/mTOR信号通路，调控Bcl-2、Bax的表达而实现。同时，CPhGs可通过上调TNF-α与IL-2的表达水平改善耐药OS荷瘤小鼠的免疫功能，从而发挥协同抗肿瘤的作用，但其临床应用潜力仍有待进一步探索研究。

1.Zhang C, Hu J, Zhu K, et al. Survival, complications and functional outcomes of cemented megaprostheses for high-grade osteosarcoma around the knee[J]. Int Orthop, 2018, 42(4): 927-938. DOI: 10.1007/s00264-018-3770-9.

2.Liu Q, Xu R, Xu X, et al. Characteristics and significance of T lymphocyte subsets in peripheral blood of osteosarcoma mice[J]. Transl Cancer Res, 2022, 11(6): 1503-1509. DOI: 10.21037/tcr-22-264.

3.吴蔚, 景豆豆, 曹理, 等. 骨肉瘤免疫治疗的现状和前景[J]. 肿瘤防治研究, 2022, 49(7): 721-726. [Wu  W, Jing DD, Cao L, et al. Current status and prospects of immunotherapy for osteosarcoma[J]. Cancer Research on Prevention and Treatment, 2022, 49(7): 721-726.] DOI: 10.3971/j.issn.1000-8578.2022.21.1281.

4.王成志, 刘一帆, 张晓青, 等. 黄芪甲苷调控免疫细胞抗肿瘤作用机制研究进展[J]. 中华中医药学刊, 2024, 42(11): 145-149. [Wang CZ, Liu YF, Zhang XQ, et al. Research progress on mechanism of astragaloside Ⅳ regulating anti-tumor action of immune cells[J]. Chinese Archives of Traditional Chinese Medicine, 2024, 42(11): 145-149.] DOI: 10.13193/j.issn.1673-7717.2024.11.029.

5.Zhang J, Yu XH, Yan YG, et al. PI3K/Akt signaling in osteosarcoma[J]. Clin Chim Acta, 2015, 444: 182-192. DOI: 10.1016/j.cca.2014.12.041.

6.胡琼, 由淑萍, 刘涛, 等. 肉苁蓉苯乙醇总苷抗肝癌作用的实验研究[J]. 癌变·畸变·突变, 2018, 30(3): 194-199. [Hu Q, You SP, Liu T, et al. An investigation on the anti-liver cancer effect of cistanche[J]. Carcinogenesis, Teratogenesis & Mutagenesis, 2018, 30(3): 194-199.] DOI: 10.3969/j.issn.1004-616x.2018.03.006.

7.齐鑫鑫, 由淑萍, 何转霞, 等. 肉苁蓉苯乙醇苷对HepG2肝癌细胞增殖和凋亡的影响[J].新疆医科大学学报, 2021, 44(9): 1041-1047. [Qi XX, You SP, He ZX, et al. Effect of Cistache deserticola phenylethanol glycoside on proliferaion and apoptosis of HepG2 cells in vitro[J]. Journal of Xinjiang Medical University, 2021, 44(9): 1041-1047.] DOI: 10.3639/j.issn.1009-5551.2021.09.012.

8.Panaampon J, Sasamoto K, Kariya R, et al. Establishment of nude mice lacking NK cells and their application for human tumor xenografts[J]. Asian Pac J Cancer Prev, 22(4): 1069-1074. DOI: 10.31557/APJCP.2021.22.4.1069.

9.于春波, 孙鹏, 张小伟, 等. 胰腺癌裸鼠皮下异种移植动物模型建立研究[J]. 现代生物医学进展, 2012, 12(9): 1648-1650. [Yu CB, Sun P, Zhang XW, et al. The animal model study of pancreatic cancer xenograft in nude mice[J]. Progress in Modern Biomedicine, 2012, 12(9): 1648-1650.] DOI: 10.13241/j.cnki.pmb.2012.09.017.

10.徐小茹, 王楠, 孙濛濛, 等. 针刺单穴与腧穴配伍对骨肉瘤模型小鼠的效应差异研究[J]. 中华中医药杂志, 2020, 35(5): 2271-2276. [Xu XR, Wang N, Sun MM, et al. Different effects in osteosarcoma model mice with acupuncture at single point and compatibility of acupoints[J]. China Journal of Traditional Chinese Medicine and Pharmacy, 2020, 35(5): 2271-2276.] DOI: 10.13241/j.cnki.pmb.2012.09.017.

11.张洪泉, 张爱香, 堵年生, 等. 肉苁蓉对小白鼠免疫功能的影响[J]. 中西医结合杂志, 1988, (12): 736-737, 710. [Zhang HQ, Zhang AX, Du NS, et al. Effects of Cistanche deserticola on immune function of mice[J]. Chinese Journal of Integrated Traditional and Western Medicine, 1988, (12): 736-737, 710.] https://www.cnki.com.cn/Article/CJFDTotal-ZZXJ198812019.htm.

12.张洪泉, 许爱华, 李电东. 肉苁蓉多糖对肿瘤和荷瘤小鼠的药理作用[J]. 中国中西医结合杂志, 1997, (S1): 155-156, 294. [Zhang HQ, Xu AH, Li DD. Pharmacological effects of Cistanche polysaccharides on tumors and tumor-bearing mice[J]. Chinese Journal of Integrated Traditional and Western Medicine, 1997, (S1): 155-156, 294.] https://kns.cnki.net/kcms2/article/abstract?v=mg_qcPBBapnmsDqon66yc8-zI2VqwJgixywPNSnAl0qboPnZqB4FNuT0bsHSSvs0Dn72KJt__SvxLZeQ8vJicy96v2o-S-Wc-bp5ClislhRETaTYT6KGBMKP3_EreGXg3-BH52Itk0rqWiNksajNxzld06uvdfRzCDj-utLfgfANyySxJMHM-g==&uniplatform=NZKPT&language=CHS

13.薛海燕, 焦婵媛, 姚军. 肉苁蓉总苷药理作用的研究现状 [J]. 中国临床药理学杂志, 2018, 34(4): 486-488. [Xue  HY, Jiao CY, Yao J. Current status of pharmacological effects of glycosides of Cistanches Herba[J]. The Chinese Journal of Clinical Pharmacology, 2018, 34(4): 486-488.] DOI: 10.13699/j.cnki.1001-6821.2018.04.026.

14.唐颖, 武建强. 肉苁蓉苯乙醇苷的抗肿瘤作用[J]. 生物技术进展, 2023, 13(3): 399-405. [Tang Y, Wu JQ. Anti-tumor effects of phenylethanoid glycosides deprived from Cistanche deserticola[J]. Current Biotechnology, 2023, 13(3): 399-405.] DOI: 10.19586/j.2095-2341.2023.0040.

15.许伟, 丁聚贤, 谢兴文, 等. 肉苁蓉对化疗耐药骨肉瘤细胞的逆转作用及MRP1、P53表达的影响[J]. 时珍国医国药, 2021, 32(3): 551-554. [Xu W, Ding JX, Xie XW, et al. Effect of Cistanche deserticola on chemotherapy-resistant osteosarcoma cells and expression of MRP1 and P53[J]. Journal of Li-shizhen Traditional Chinese Medicine, 2021, 32(3): 551-554.] DOI: 10.3969/j.issn.1008-0805.2021.03.11.

16.候晓甜, 刘涛, 苏德奇. 肉苁蓉苯乙醇总苷对H22荷瘤小鼠皮下移植瘤抑制作用的实验研究[J]. 毒理学杂志, 2021, 35(3): 231-235, 240. [Hou XT, Liu T, Su DQ. Anti-tumor effect of phenylethanol glycosides from Cistanche deserticola on H22 tumor-bearing mice[J]. Journal of Toxicology, 2021, 35(3): 231-235, 240.] DOI: 10.16421/j.cnki.1002-3127.2021.03.010.

17.张欣雨, 王丹, 付春雪, 等. 白细胞介素-2治疗肿瘤的研究进展[J]. 癌症进展, 2024, 22(6): 581-585, 618. [Zhang XY, Wang D, Fu CX, et al. Research progress on the treatment of tumors with interleukin-2[J]. Oncology Progress, 2024, 22(6): 581-585, 618.] DOI: 10.11877/j.issn.1672-1535.2024.22.06.01.

18.高世勇, 李丹. 肿瘤坏死因子与癌症相关研究进展[J]. 中国药理学通报, 2020, 36(9): 1209-1213. [Gao SY, Li D. Research advances in tumor necrosis factor and cancer[J]. Chinese Pharmacological Bulletin, 2020, 36(9): 1209-1213.] DOI: 10.3969/j.issn.1001-1978.2020.09.006.

19.周慧, 海广范, 张涛, 等. 癌症治疗中PI3K/AKT/mTOR通路及靶向抑制剂研究进展[J]. 中国药业, 2023, 32(5): 127-135. [Zhou H, Hai GF, Zhang T, et al. Research progress of PI3K/AKT/mTOR pathway and its targeted inhibitors in cancer treatment[J]. China Pharmaceuticals, 2023, 32(5): 127-135.] DOI: 10.3969/j.issn.1006-4931.2023.05.030.

20.刘彦娟, 曹雨虹, 匡荣. 肿瘤多药耐药发生机制及中药逆转研究进展[J]. 中国药学杂志, 2024, 59(7): 561-570. [Liu  YJ, Cao YH, Kuang R. Research progress of mechanism of tumor multidrug resistance and reversal by traditional Chinese medicine[J]. Chinese Pharmaceutical Journal, 2024, 59(7): 561-570.] DOI: 10.11669/cpj.2024.07.001.

21.杨浩东, 李宁, 谢兴文, 等. 中药单体调控PI3K/Akt/mTOR信号通路治疗骨肉瘤的研究进展[J]. 中国实验方剂学杂志, 2023, 29(3): 254-262. [Yang HD, Li N, Xie XW, et al. Chinese medicine monomers in treatment of osteosarcoma by regulating PI3K/Akt/mTOR signaling pathway: a review[J]. Chinese Journal of Experimental Traditional Medical Formulae, 2023, 29(3): 254-262.] DOI: 10.13422/j.cnki.syfjx.20221527.