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目的 筛选胰腺导管腺癌（pancreatic ductal adenocarcinoma，PDAC）铁死亡核心基因及预后分析。
方法 基于基因表达综合（Gene Expression Omnibus，GEO）数据库，选取GSE71989数据集，借助limma包和铁死亡数据集对差异表达基因（differentially expressed genes，DEGs）进行筛选。利用Metascape数据库进行富集分析、String数据库建立蛋白质互作网络（protein-protein interaction network，PPI），采用最大集团中心性（matthews correlation coefficient，MCC）算法筛选预后相关核心基因。利用Kaplan Meier plotter、R、GEPIA2和TIMER数据库对所筛选的核心基因进行预后分析并验证，基于CMap数据库筛选PDAC潜在治疗药物。
结果 筛选共得到2 038个DEGs，其中上调基因1 552个、下调基因486个，与铁死亡数据集相交，得到 66个共同DEGs；京都基因和基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）通路分析显示，铁死亡相关基因富集通路包括铁死亡途径、白介素-17（interleukin-17，IL-17）信号通路、化学致癌作用-活性氧通路、过氧化物酶体增殖物活化受体（peroxisome proliferator-activated receptor，PPAR）信号通路和低氧诱导因子-1（hypoxia inducible factor-1，HIF-1）信号通路等；MCC算法得到预后核心靶点：还原氢氧化酶4（NADPH oxidase 4，NOX4）、小窝蛋白-1（caveolin-1，CAV1）、缺氧诱导因子1α（hypoxia inducible factor 1 subunit alpha，HIF1A）、过氧化物酶体增殖因子激活受体γ（peroxisome proliferator activated receptor gamma，PPARG）、白介素-6（interleukin-6，IL-6）、前列腺素内过氧化物合成酶 2（prostaglandin-endoperoxide synthase 2，PTGS2）；验证分析提示核心基因均为高表达基因、与患者总生存率密切且均具有诊断价值（P＜0.05）；免疫浸润表明NOX4、HIF1A和IL-6基因与巨噬细胞、中性粒细胞浸润水平呈正相关关系（P＜0.05）。NOX4、CAV1和H1F1A基因与CD8+、DC细胞浸润水平呈正相关关系（P＜0.05）。筛选所得小分子药物包括HU-211、伊斯平斯和熊果酸，且所得小分子均与PDAC有较强相关性。
结论 基于整合数据库筛选所得铁死亡相关基因（NOX4、CAV1、HIF1A、PPARG、IL-6、PTGS2）对PDAC有较高诊断价值，可能为预后相关诊断指标。
胰腺导管腺癌（pancreatic ductal adenocarcinoma，PDAC）是最常见且最具侵袭性的胰腺癌，占所有胰腺恶性肿瘤的95%[1]。PDAC恶性转化率已超过乳腺癌，成为美国癌症相关死亡的第三大原因，其发病率预计将在2040年前超过结直肠癌，成为癌症高致死率的主要原因，此外，PDAC在所有实体肿瘤中预后最差，5年生存率约为10%[2]。因其高侵袭性的生物学特性、特异的临床症状，以及缺乏可靠的早期发现和诊断的生物标志物，多数PDAC患者出现局部晚期或转移性疾病，不适合早期的治愈性手术切除 [3]。因此，寻找潜在的诊断和预后生物标志物可能为PDAC患者的精准诊断和治疗提供帮助。
铁死亡在癌症研究领域越来越受到关注。一方面，铁死亡与细胞内铁过载、细胞内谷胱甘肽消耗、谷胱甘肽过氧化物酶活性降低、脂质活性氧积累有关；另一方面，铁死亡常与线粒体体积减小、双层膜密度增加和线粒体嵴的减少或消失有关[4]。研究发现，铁死亡途径可作为易转移癌细胞和耐药性癌细胞的重要治疗策略[5]。PDAC恶变则依赖于线粒体代谢功能、活性氧含量及细胞内氧化应激水平，与铁死亡发生机制一致[6]。然而，铁死亡作为生物靶标，在PDAC的诊断、预后和治疗方面尚未完全阐明。本研究借助基因表达综合（Gene Expression Omnibus，GEO）数据库、铁死亡（Ferroptosis，FerrDb）数据库、Metascape及String等平台对PDAC铁死亡核心基因进行筛选及通路富集，初步挖掘PDAC铁死亡核心生物标志物，并利用癌症基因组图谱（The Cancer Genome Atlas，TCGA）数据库及Kaplan Meier plotter等平台对核心基因进行验证分析，进一步研究PDAC与核心生物标志物的相互作用，最后对核心基因进行药物敏感性分析，深入挖掘治疗PDAC的潜在化合物。
1 资料与方法
1.1 数据来源
借助GEO数据库（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/ geo/），搜索框中输入PDAC，选取GSE71989数据集，将GSE71989数据集于Affymetrix Human Genome U133 Plus 2.0 Array平台处理分析，得到8例正常胰腺组织样本和14例PDAC组织样本，应用主成分分析对数据进行质量评估后，对其分别应用TCGA数据库（https://www.cancer.gov/tcga/）中的179例PDAC样本、基因型组织表达（Genotype-Tissue Expression，GTEx）数据库（https://www.genome.gov/Genotype-Tissue-Expression-Project）中的191例正常胰腺组织样本进行筛选基因验证，而后根据FerrDb数据库（http://www.zhounan.org. ferrdb）中728例涉及铁死亡的基因数据集进一步筛选与铁死亡有关的PDAC基因。
1.2 差异表达基因筛选
采用R 4.0软件limma包对正常胰腺组织与PDAC的差异表达基因（differentially expressed genes，DEGs）进行筛选，采用P值和差异倍数（foldchange，FC）的对数（logFC）表示基因表达的差异。设定命令包中的参数P＜0.05且|logFC| ＞3的DEGs具有统计学意义。利用ggplot2包绘制DEGs火山图，利用pheatmap包绘制热图，利用Venny 2.1网站（https:// bioinfogp.cnb.csic.es/）在线获取数据集交集靶点并进行整理。
1.3 京都基因和基因组百科全书富集分析及核心基因筛选
基于Metascape数据库（http://metascape.org/），将所得到的DEGs以P＜0.05为标准进行京都基因和基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）富集分析和基因本体（Gene Ontology，GO）功能富集分析，并对结果进行可视化。借助String 11.0 数据库（https://cn.string-db.org）提取DEGs靶点信息，利用Cytoscape3.9.1软件（http://www. cytoscape.org）建立蛋白质互作网络（protein-protein interaction network，PPI），同时利用其中cytoHubba插件最大集团中心性（matthews correlation coefficient，MCC）算法进一步筛选PDAC预后相关核心基因。
1.4 核心基因预后表达
为研究核心基因在PDAC样本的存活情况，利用Kaplan Meier plotter网站（http://kmplot.com.analysis）进行分析，筛选PDAC中表达与存活率存在明显相关性的基因（P＜0.05）。
1.5 诊断价值分析
以TCGA和GTEx数据库中179例PDAC样本和191例正常胰腺组织样本作为测试集，下载相关表达谱文件，利用 R 4.0软件pROC 包分析关键靶点在测试集样本中的差异表达并绘制受试者工作特征（receiver operator characteristic，ROC）曲线，通过曲线下面积（area under curve，AUC）判断其准确性，分析结果利用Graphpad Pism 9.5软件进行可视化。
1.6 核心基因验证
在GEPIA2数据库（http://gepia. cancer-pku.cn）对PDAC核心基因进行验证，默认参数设定为|log2FC|=1.0、P=0.01，进一步利用GEPIA2数据库分析核心基因表达与PDAC分期的关系。
1.7 核心基因免疫浸润分析
采用TIMER 2.0数据库（http://timer. cistrome.org/）在线分析PDAC预后相关核心基因的表达水平与B细胞、CD4+、CD8+、巨噬细胞、中性粒细胞和DC细胞免疫浸润的关系。
1.8 筛选潜在治疗药物
将DEGs输入CMap数据库（https://clue.io/）筛选PDAC治疗药物，query选择“Gene expression（L1000），Latest”进行分析。
2 结果
2.1 DEGs筛选
选用GEO数据库GSE71989微阵列数据集作为数据来源，分析8个正常胰腺组织和14个PDAC组织的表达谱，主成分分析结果显示，正常胰腺组织和PDAC组织能显著分离，表明数据集质量良好，见图1-A。进一步分析得到2 038个DEGs，其中上调基因1 552个、下调基因486个，见图1-B。与铁死亡数据集相交，得到66个共同DEGs，见图1-C。
2.2 富集分析及核心基因筛选
KEGG通路分析结果显示，66个PDAC铁死亡相关基因富集通路包括铁死亡途径、白细胞介素-17（interleukin-17，IL-17）信号通路、化学致癌作用-活性氧通路、过氧化物酶体增殖物活化受体（peroxisome proliferator-activated receptor，PPAR）信号通路和低氧诱导因子-1（hypoxia inducible factor-1，HIF-1）信号等通路，见图2-A。GO功能富集分析筛选出相关性最高的前10条反应过程，见图3。生物进程（biological process，BP）主要涉及对无机物质的反应、对氧化应激的反应、细胞对氮化合物的反应以及对激素的反应；分子功能（molecular function，MF）主要参与氧化还原酶活性、NAD+ ADP核糖基转移酶活性、NAD+蛋白ADP核糖基转移酶活性和激酶结合；细胞组成（cellular component，CC）主要涉及细胞顶端、顶端质膜、RNA聚合酶II转录调节复合体及黑色素体。经String数据集可视化后得到PPI网络，其中靶点平均degree为6.45，移除PPI网络中与主要网络离散且边缘较少的节点后，最终呈现58个节点和213条边，见图2-B。MCC算法得到前六位基因分别为NOX4、CAV1、HIF1A、PPARG、IL-6、PTGS2，见图2-C，提示上述基因可能是影响PDAC预后的核心靶点。
2.3 核心基因的生存分析
生存分析结果显示，NOX4、CAV1、HIF1A、PPARG、IL6、PTGS2基因均为高表达基因，且与患者的总生存率具有相关性（P＜0.05），见图4。
2.4 诊断价值分析
ROC曲线结果显示，所筛选的核心基因AUC值均大于0.7，其中PPARG、PTGS2、HIF1A基因的AUC值≥0.95，具有较高的诊断价值，见图5。
2.5 核心基因验证
借助GEPIA2数据库验证核心基因的差异表达，结果显示，NOX4、CAV1、HIF1A、PPARG、IL-6、PTGS2基因在179例PDAC患者中高表达，与171例正常人群的差异有统计学意义（P ＜0.05），见图6。而核心基因临床分期表达情况显示，仅PPARG基因表达在PDAC患者各期的差异有统计学意义（P ＜0.05），见图7。
2.6 免疫浸润分析
免疫细胞浸润分析结果显示，NOX4、HIF1A、IL-6基因与巨噬细胞、中性粒细胞浸润水平呈显著正相关关系，NOX4、CAV1与H1F1A基因与CD8＋、DC细胞浸润水平呈显著正相关关系，见图8。
2.7 潜在药物筛选
CMap数据集中raw_cs、norm_cs可作为药物疾病紧密度评价的首选，阳性数值表明小分子药物可加速PDAC进展，加重发病；阴性数值表明可削弱或减缓PDAC进展，且绝对值越高表明小分子药物可能对PDAC疗效越显著。将基于MCC算法前十位的Hub基因输入CMap数据库，筛选出3种与PDAC基因模块表达负相关的小分子药物，分别为HU-211、伊斯平斯和熊果酸，见表1。
3 讨论
胰腺癌被称为“癌中之王”，其中PDAC是其最常见的恶变类型[7]。因此，预测PDAC核心靶基因及筛选减弱PDAC侵袭力的有效小分子药物至关重要。自高通量测序和微量测定技术出现以来，生物信息学方法逐渐得到应用。本研究通过整合多个开源数据库，借助多种分析工具对PDAC的核心基因进行筛选并加以验证，同时对显著差异基因进行小分子药物预测，以期为治疗PDAC新药开发提供新思路。
基于GSE71989数据集识别和分析共2 038个DEGs。铁死亡交集的PPI网络中发现了66个枢纽基因，MCC算法插件进一步将六个基因（NOX4、CAV1、HIF1A、PPARG、IL-6、PTGS2）筛选为核心基因并加以验证。缺氧可激活HIF1A和NOX4并促进多种癌症进展，而缺氧是胰腺癌微环境的一大特征[8]。缺氧诱导在胰腺癌中以HIF1A非依赖性方式上调NOX4使赖氨酸去甲基化酶5A失活，增加组蛋白H3的甲基化修饰，并调节上皮间质转换（epithelial-mesenchymal transition，EMT）相关蜗牛家族转录抑制因子1的转录，从而促进胰腺癌的侵袭和转移[9]。此外，铁死亡也是缺氧相关疾病的治疗靶点，铁死亡抑制剂可能通过激活Jun原癌基因/p38丝裂原活化蛋白激酶/丝裂原激活蛋白激酶（Jun proto-oncogene/p38 mitogen-activated protein kinase/mitogen-activated protein kinase，JNK/p38/MAPK）通路和上调NOX4表达诱导人胰岛细胞簇铁死亡，但铁死亡抑制剂在PDAC治疗中的应用尚未见报道。PPARG是过氧化体增殖激活受体，其差异表达已被证明与多种人类癌症相关[10]。Yamashita等发现环磷酸鸟苷抗胰腺导管腺癌可通过诱导上调过氧化物酶体增殖物活化受体α（peroxisome proliferator-activated receptor alpha1，PPARα）/丙酮酸脱氢酶激酶同工酶4（recombinant pyruvate dehydrogenase kinase isozyme 4，PDK4）通路并抑制癌症干细胞特性，这提示PPARG可能为根除胰腺癌症干细胞提供新的治疗靶点[11]。IL-6是PDAC发病机制的驱动因素。研究表明，在PDAC肿瘤微环境中IL-6的存在可以驱动转录激活因子 3（transcription activating factor 3，STAT3）的激活，IL-6/STAT3程序通过增强肿瘤的发生和发展、血管生成、调节细胞因子表达和免疫细胞行为、抗细胞凋亡和促进转移，是PDAC发病机制的驱动因素[12-13]。在预后方面 ，血清IL-6可作为PDAC的预后标志物[14]。
KEGG结果显示，PDAC恶变机制可能与铁死亡途径、IL-17信号通路、化学致癌作用-活性氧通路、PPAR信号通路和HIF-1信号等通路相关。PDAC具有半胱氨酸依赖性特性，可以通过合成谷胱甘肽降低自身的氧化应激，从而抑制铁死亡水平，提高肿瘤细胞的存活率[15]。细胞色素P450表氧化酶2J2（cytochrome P450 arachidonic acid epoxygenase 2J2，CYP2J2）和环氧二十碳三烯酸（epoxyeicosatrienoic acids，EETs）在PDAC组织中高表达，EETs通过以过氧化物酶体增殖物激活受体依赖性方式上调谷胱甘肽过氧化物酶4来抑制铁死亡，这提示铁死亡途径在PDAC的发展中起着至关重要的作用，其结果与本研究一致[16]。Zhang等研究发现，IL-17阻断可能抑制中性粒细胞募集到PDAC并特异性增加活化的细胞毒性CD8+T细胞，而缺乏IL-17和白细胞介素-17受体A亚基（interleukin-17 receptor A1，IL17R）信号转导可显著抑制体内肿瘤生长，该机制有望为新药物研发提供思路[17]。
探究肿瘤微环境可为肿瘤恶变机制提供新见解[7]。免疫浸润结果显示，NOX4、HIF1A和IL-6基因与巨噬细胞、中性粒细胞浸润水平呈显著正相关。IL-6是M2巨噬细胞极化后分泌的关键炎症分子，而胰腺癌细胞产生相关外泌体，引起M2巨噬细胞极化聚集，产生大量IL-6，从而促进胰腺癌细胞的恶性生物学行为，与上述研究结果一致[18]。NOX4、CAV1和H1F1A基因与CD8+、DC细胞浸润水平呈显著正相关关系。TLR4和 TNF信号转导与CAV1表达有关，其表达在DC 细胞成熟后上调，而核因子κB可作为Toll样受体和肿瘤坏死因子依赖性成熟DC细胞的主要调节分子[19]，但尚未见CAV1与DC细胞在PDAC研究中的相关报道。
潜在药物结果筛选结果显示，HU-211、伊斯平斯和熊果酸三种小分子药物评分接近-1，与抑制PDAC进展密切相关。HU-211属于谷氨酸受体抑制剂，既往研究发现，异丙酚可通过抑制HIF-1α的表达来减弱癌细胞的恶性潜力[20]。Chen等研究发现，NMDA受体抑制剂可抑制血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）、HIF-1a的表达、肿瘤生长和体内VEGF的表达，进而抑制减弱胰腺癌恶性潜力，异丙酚可能通过抑制N-甲基-D-天冬氨酸（N-Methyl-D-aspartic acid，NMDA）受体发挥疗效[21]。HU-211是否具有相似机理有待进一步探究。Kinesin抑制剂伊斯平斯已被证实对PDAC细胞增殖具有抑制作用，其可引起PDAC细胞的G2/M 细胞周期停滞，并抑制特征性有丝分裂，从而诱导癌细胞凋亡[22]。但伊斯平斯在PDAC方面尚未有临床研究报道[23]。熊果酸是天然五环三萜类化合物，具有抗癌能力[24]。Lin等研究发现，熊果酸处理后的胰腺癌细胞可通过上调促凋亡BAX蛋白表达和下调抗凋亡Bcl-2蛋白表达来诱导癌细胞凋亡，同时提高癌细胞对吉西他滨的敏感性， 可为临床用药提供方向[25]。本研究筛选出了一些PDAC的特征基因，但仍存在一定局限性：数据集需进一步的实验验证；数据集芯片纳入的PDAC患者与健康对照者的性别、年龄、身体状况和地域分布等基本信息缺失；用于表达量分析的样本量较少等。
综上所述，本研究通过整合数据库筛选得到六个PDAC铁死亡核心基因（NOX4、CAV1、HIF1A、PPARG、IL-6、PTGS2）和三种治疗PDAC的小分子药物，有望为PDAC的临床精准诊断与预后提供参考。未来有待对上述核心基因加以实验证实，进一步从分子水平深入探究PDAC的作用机制。
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