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目的 探究全身炎症因子与肝癌发生风险之间的因果关系。
方法 本研究基于公开的全基因组关联研究（genome-wide association study，GWAS）数据库，以41个全身炎症因子为暴露因素，数据来源于一项样本量为8 293人的芬兰研究；以肝癌为结局变量，数据来源于芬兰数据库（FINNGen）。分别采用逆方差加权法（inverse variance weighted，IVW）、MR-Egger、加权中位数（weighted median estimator，WME）、加权模式法（weighted mode，WM）进行两样本孟德尔随机化分析，采用MR-Egger回归进行多效性分析，利用Cochran's Q检验进行异质性分析，采用“留一法”进行敏感性分析。
结果 两样本孟德尔随机化分析的IVW法结果显示，肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体（TNF-related apoptosis-inducing ligand，TRAIL）水平（OR=0.77，95%CI：0.61~0.97，P=0.025）、巨噬细胞集落刺激因子（macrophage-stimulating factor，MCSF）水平（OR=0.69，95%CI：0.50~0.95，P=0.024）和白细胞介素-18（interleukin-18，IL-18）水平（OR=0.77，95%CI：0.61~0.97，P=0.026）与肝癌发生风险呈负相关关系。
结论 TRAIL、IL-18、MCSF与肝癌存在潜在的负向因果关联，可能为肝癌的保护因素。
肝细胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC，简称肝癌）是一种常见的消化道恶性肿瘤，具有发病隐匿、进展迅速、治疗效果不佳、预后极差的特点，死亡率居全球第三[1]。HCC的高致死率对人类健康构成严重威胁，因此寻找针对HCC的有效治疗方法已成为当前医学领域面临的重大挑战。
炎症因子是一种由免疫细胞和组织细胞分泌的蛋白质分子，可通过细胞之间的信息交流来调节机体的免疫和炎症反应。根据炎症因子不同的免疫调节作用，可将其分为促炎细胞因子和抗炎细胞因子[2]。Virchow于1863年首次阐述了炎症在癌症发展中的潜在作用：炎症细胞会浸润肿瘤细胞，并且慢性炎症与肿瘤间存在密切的相关性[3]。在肿瘤形成的早期，炎症细胞与促炎细胞因子作为启动因子显著影响肿瘤的发生与生长[4]，因此炎症因子在HCC的发生、侵袭和转移过程中发挥着重要作用。研究表明，HCC患者白细胞介素-1β（interleukin -1beta，IL-1β）、单核细胞趋化蛋白1（monocyte chemoattractant protein 1，MCP-1）、转化生长因子-β（transforming growth factors-β，TGF-β）[5]、白细胞介素-22（interleukin-22，IL-22）[6]的表达水平升高，而白细胞介素-12（interleukin-12，IL-12）[7]、白细胞介素-36（interleukin-36，IL-36）[8]表达水平降低。然而，由于既往相关研究的样本量较小，统计效力受限，不同炎症因子与HCC之间的因果关系有待验证。
孟德尔随机化（Mendelian randomization，MR）以遗传变异为工具变量来估计和量化表型与结局间的因果关系，具有样本量大、能够免受混杂及其他因素的影响等优点[9]。本研究采用两样本MR分析法对全身炎症因子与HCC的因果关系进行验证，为预防及治疗HCC提供有力的循证依据。
1 资料与方法
1.1 研究设计
以41个全身炎症因子为暴露因素，与41个炎症因子相关的单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphisms，SNPs）作为MR分析的工具变量（instrumental variables，IVs），以HCC为结局变量，运用两样本MR分析的方法进行因果分析。MR分析中选择的IVs必须满足以下3个假设：①IVs与暴露因素显著相关；②IVs只能通过暴露因素影响结局，对结局无直接影响；③IVs在暴露因素与结局的关联性中无混杂因素[10]，见图1。
1.2 数据来源
本研究数据均来源于公开可用的全基因组关联研究（genome-wide association study，GWAS）数据库。HCC的遗传数据来自于FINNGen数据库[11]。41个全身炎症因子的SNPs来自于Ahola-Olli AV等的GWAS[12]，该研究纳入三项独立人群队列的8 293名芬兰人，包括芬兰年轻人的心血管风险研究、FINRISK1997研究和FINRISK2002研究。
1.3 IVs的选择
为满足MR分析的第一大假设，IVs需满足以下条件：①在全基因组水平上有意义（P＜5×10-8）；②连锁不平衡参数（R2）＜0.001，碱基物理距离（distance）＜10 000 kb[13]；③代表MR的强度F值＞10[14]，F=R2（N-2）/（1-R2）；④排除与混杂因素（乙型肝炎、丙型肝炎、酒精性肝病等）有关的SNPs。
1.4 MR分析
采用逆方差加权法（inverse variance weighted，IVW）、MR-Egger、加权中位数（weighted median estimator，WME）、加权模式法（weighted mode，WM）进行两样本MR分析。以IVW法的结果为准（P＜0.05为具有统计学意义），采用MR-Egger回归进行多效性分析（P＜0.05说明存在水平多效性），通过多效性残差和离群值（MR pleiotropy residual sum and outlier，MR-PRESSO）检验剔除影响多效性的离群SNPs，采用Cochran's Q检验进行异质性分析（P＜0.05说明存在异质性），采用“留一法”进行敏感性分析。
2 结果
2.1 IVs的选择
在41个全身炎症因子中，只有27个具有至少一个全基因组显著SNPs（P＜5×10-8），而41个在使用较高临界值时均至少具有一个SNPs（P ＜5×10-6）[15]。这些所有SNPs均包含在分析中，见表1，F统计量均大于10，表明结果受到弱IVs影响的概率较小。
2.2 MR分析结果
当使用具有较高显著性临界值的SNPs时（P ＜5×10-6），IVW法分析结果显示，肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体（TNF-related apoptosis-inducing ligand，TRAIL）水平（OR=0.77，95%CI：0.61~0.97，P=0.025）、巨噬细胞集落刺激因子（macrophage-stimulating factor，MCSF）水平（OR=0.69，95%CI：0.50~0.95，P=0.024）和白细胞介素-18（interleukin -1beta，IL-18）水平（OR=0.77，95%CI：0.61~0.97，P=0.026）与HCC发生风险呈负相关关系，见图2。MR-Egger和MR-PRESSO未检测到TRAIL、MCSF和IL-18的潜在水平多效性（P＞0.05），MR-Egger回归结果见图3。采用Cochran's Q检验未检测到TRAIL（P=0.699）、MCSF（P=0.974）和IL-18（P=0.978）的异质性，见表2。在使用WME法的MR分析中，IL-18水平（OR=0.73，95%CI：0.53~1.00，P=0.049）与HCC发生风险呈负相关，而TRAIL水平和MCSF水平与HCC发生风险无显著相关性。但经“留一法”分析，结果显示有个别SNPs对MR分析具有显著影响，见图4。
3 讨论
本研究通过MR分析系统评估了全身41种炎症因子与HCC发生风险间的因果关系，结果提示TRAIL、IL-18、MCSF的表达水平与HCC发生风险呈负相关关系。
TRAIL是肿瘤坏死因子超家族中的一员，是一种由281个氨基酸构成的Ⅱ型跨膜蛋白。胸腺、脾脏、小肠、结肠等多种人类组织以及自然杀伤（natural killer，NK）细胞、B细胞、单核细胞、树突状细胞等免疫细胞中均有TRAIL的表达，TRAIL在免疫调节、炎症反应和细胞凋亡等活动中也起到关键作用[16-17]。TRAIL通过诱导细胞凋亡来特异性杀伤多种肿瘤细胞，但对非肿瘤细胞无明显细胞毒性[18]。Piras-Straub等检测到在66%肝癌的肿瘤中，TRAIL表达水平显著低于周围非癌性肝组织[19]，这提示TRAIL表达水平的降低可能是HCC发生的标志。推测高水平TRAIL降低HCC发生风险的机制可能是其与肝癌细胞中DR4、DR5促凋亡受体结合触发细胞凋亡，也可能是诱导肝癌细胞中RIP与c-FLIP基因沉默，从而诱导HCC细胞凋亡[20-21]。因此，TRAIL可作为HCC治疗的重要靶点。Helmy等的研究表明，上调TRAIL的表达可以改善HCC大鼠的肝功能，减缓HCC进展[22]；冯全林等运用重组人TRAIL蛋白有效地诱导人肝癌细胞HepG2凋亡[23]。以上研究均提示TRAIL是HCC的保护因素。
IL-18是细胞因子IL-1家族的成员之一，最早被描述为“干扰素-γ诱导因子”，与IL-1β密切相关，作为无活性前体合成，由Caspase-1进行切割，可经蛋白酶-3胞外加工，且具有诱饵受体。IL-18是NK细胞与极化Th1细胞、巨噬细胞相互作用的重要介质，能够增强NK细胞和细胞毒性T淋巴细胞的细胞毒活性[24]。转染了IL-18基因的Lewis肺癌细胞株LLC[25]、C6胶质瘤细胞[26]和小鼠卵巢癌细胞OVHM[27]的体内致瘤性均显著降低。临床数据显示，原发性HCC患者血清中的IL-18表达量明显低于正常人[28]，该研究为本研究结果提供了有力支持。研究表明，IL-18在HCC肿瘤生长中总体发挥抑制作用，调节淋巴细胞的积累及其功能[29]。对H22荷瘤小鼠应用不同剂量的rmIL-18，结果表明，对肿瘤生长速度的抑制作用和小鼠的存活率与剂量呈正相关关系；另外，使用相同剂量的rmIL-18，肿瘤内应用的抗肿瘤效果较腹腔内应用更为显著[30]。据此推测IL-18对HCC的保护机制主要是通过促进肿瘤浸润性T细胞的分化、活性和存活来抑制肿瘤生长。
MCSF又称CSF-1，是一种主要存在于骨髓腔内、具有谱系特异性的细胞因子，是由键间二硫键连接而成的二聚体糖蛋白。MCSF能够刺激单核巨噬细胞生长形成集落，诱导巨噬细胞增殖分化[31]。对于肿瘤细胞，MCSF发挥着双重作用。Kirma等的研究表明，MCSF高表达促进乳腺癌转基因小鼠癌前肿瘤变化的发展[32]；Eubank等的研究证实，MCSF的表达会诱导人单核细胞产生血管内生长因子（VEGF），促进肿瘤形成新生血管，利于肿瘤的进展[33]。然而，Kawakami等的研究发现，MCSF能够在体外抑制人卵巢癌细胞的生长[34]。国内外MCSF对HCC的相关临床研究较少，两者间的因果关系还有待进一步研究证实。
本研究利用两样本MR分析提供了可靠的结果，但也存在一定的局限性：首先，本研究用于MR分析的样本量较少，筛选出的有效SNPs数量较少，部分炎症因子无法筛选出符合条件的SNPs。虽然降低临界值以助IVs的筛选，但可能无法完全避免弱IVs对结局的影响。其次，研究人群为芬兰人群，欧洲人群与其他人群存在个体差异，提示本研究结果不可直接应用于亚洲人群。最后，本研究探讨的关联较不稳健，尤其是MCSF与HCC的关联受第一个SNP的影响较大。
综上所述，本研究通过MR分析对全身炎症因子与HCC发生风险进行因果关系的探讨，结果显示，在欧洲人群中，TRAIL、IL-18、MCSF与HCC存在潜在的负向因果关联，可能为HCC的保护因素。本研究结果有待进一步实验证实，但可以为HCC的防治提供新思路。
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