目的  探讨去整合素金属蛋白酶12（a disintergin and metalloprotease 12，ADAM12）、黏蛋白3A（mucin 3A，MUC3A）和黏蛋白17（mucin 17，MUC17）基因在胃癌中的表达及生存预后关系。

方法  收集癌症基因组图谱（The Cancer Genome Atlas，TCGA）、基因表达谱交互分析2（Gene Expression Profiling Interactive Analysis 2， GEPIA2）数据库信息，采用R 4.2.2和SPSS软件分析ADAM12、MUC3A和MUC17基因在胃癌中的差异性表达、生存预后关系、泛癌表达，以及不同临床病理特征与基因表达量之间的相关性。通过人类蛋白质图谱（Human Protein Atlas，HPA）数据库分析三种基因在正常组织中的表达水平。利用基因本体论（Gene Ontology，GO）和京都基因与基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）功能富集分析评估三种基因在胃癌中的潜在功能。采用实时荧光定量聚合酶链反应（quantitative real-time polymerase chain reaction，q-PCR）进一步验证肿瘤组织与癌旁组织中ADAM12、MUC3A和MUC17的表达情况。

结果  生物信息学及q-PCR结果显示，ADAM12、MUC3A和MUC17在正常组织中表达量较低，在胃癌组织中表达量均被上调（P＜0.05），且ADAM12在胃癌中伴随着不良预后（P＜0.05）。三种基因在肿瘤相关通路富集，与胃癌的发生发展有关。

结论  ADAM12、MUC3A和MUC17在胃癌中高表达，其中ADAM12是胃癌预后的影响因素。三种基因参与肿瘤的进展，均有可能成为胃癌潜在的治疗靶点。

胃癌（gastric cancer，GC）主要起源于胃最表层的腺体或黏膜，是消化系统常见的恶性肿瘤，也是全球第五大最常见癌症和第四大癌症死亡原因，具有起病隐匿、易转移和预后差等特点[1-2]。尽管外科手术技术不断进步，新的化疗方案不断改进，但GC患者的五年生存率仍低于30%[3]。近年来，免疫治疗和靶向治疗在肿瘤治疗领域取得了重大进展。然而，针对GC的靶向药物选择仍非常有限[4]。因此，寻找有效的新型肿瘤抗原靶点具有重要意义。去整合素金属蛋白酶12（a disintergin and metalloprotease 12，ADAM12）是一种具有多个功能结构域的重要跨膜糖蛋白，具有蛋白水解活性，与癌症等多种疾病的发生和发展密切相关[5-7]。黏蛋白3A（mucin 3A，MUC3A）属于膜相关黏蛋白，含有作为O-糖基化支架的胞外结构域，在癌细胞的迁移和侵袭中发挥重要作用[8-9]。黏蛋白17（mucin 17，MUC17）作为膜结合黏蛋白基因的一种，参与了多种细胞信号转导过程，并且可能与癌症发病机制有关[10]。然而，三种基因在GC中的表达及生存预后尚不明确。本研究旨在探讨ADAM12、MUC3A和MUC17在GC中的表达水平、生存预后关系及潜在功能，为GC临床治疗靶点的研究提供参考。

1 资料与方法

1.1 数据来源

RNA-Seq数据均来源于癌症基因组图谱（The Cancer Genome Atlas，TCGA）数据库（https:// www.cancer.gov/ccg/research/genome-sequencing/tcga），共获取407例GC患者的临床信息数据以及ADAM12、MUC3A和MUC17基因的mRNA表达数据。

1.2 临床样本收集

组织样本取自武汉大学中南医院胃肠外科确诊的GC患者，共收集了16例GC患者的肿瘤组织及邻近正常胃组织。本研究获得武汉大学中南医院医学伦理委员会批准（2019165），患者被告知研究目的、标本内容和潜在风险，并签署了知情同意书。

1.3 实时荧光定量PCR

采用Trizol法提取组织标本总RNA，微量分光光度计检测RNA浓度及纯度，使用Evo M-MLV反转录试剂盒（Thermo Fisher, MA，USA）将mRNA逆转录成cDNA后，在CFX96实时PCR检测系统中使用SYBR Green试剂（MCE）配置体系进行q-PCR。采用2-ΔΔCT法计算ADAM12、MUC3A和MUC17基因与GAPDH的相对表达水平。引物由北京擎科生物技术有限公司（中国北京）合成,序列见表1。

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  表格1 q-PCR引物序列

  Table 1.q-PCR primer sequences

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1.4 生物信息学分析

从TCGA数据库中获取375例GC样本和32例正常组织样本。采用R 4.2.2软件绘制差异表达基因火山图，以|log2 fold change（logFC）|＞1.0，校正后的P值（Padj）＜0.05作为差异基因筛选标准。从基因表达谱交互分析2（Gene Expression Profiling Interactive Analysis 2，GEPIA2）数据库（http://gepia2.cancer-pku.cn/#general）中获取生存预后分析曲线及基因泛癌表达情况。利用人类蛋白质图谱（Human Protein Atlas，HPA）数据库（https://www.Proteinatlas.org/）分析基因在正常组织中的RNA表达水平。基于TCGA数据库信息，将GC样本中三种基因表达量根据中位数进行分组并获取差异表达基因，采用R 4.2.2软件对差异基因进行基因本体论（Gene Ontology，GO）和京都基因与基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）功能富集分析并绘图。GO功能富集分析用于评估生物过程（biological process，BP）、分子功能（molecular function，MF）和细胞成分（cellular component，CC），KEGG分析用于检查富集通路。

1.5 统计学方法

统计学分析采用R 4.2.2、SPSS 26.0和GraphPad Prism 9软件，临床病理特征比较采用χ²检验或Fisher精确检验，组间比较采用独立样本t检验。以P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 ADAM12、MUC3A和MUC17在GC中的表达

如图1-A所示，ADAM12、MUC3A 和MUC17在GC组织中表达上调。为分析ADAM12、MUC3A及MUC17对GC患者总生存期（overall survival，OS）的影响，利用GEPIA2数据库分析 结果显示，ADAM12与GC患者的OS呈负相关关系，其表达量增加会导致患者预后不良。而MUC3A和MUC17的表达与GC患者的OS的相关性无统计学意义（P＞0.05）（图1-B、图1-C、图1-D）。与正常组织相比，ADAM12、MUC3A和MUC17在多数癌症类型中的表达均被上调，包括胃腺癌（stomach adenocarcinoma，STAD）、结肠癌（colon adenocarcinoma，COAD）和胰腺癌（pancreatic adenocarcinoma，PAAD）等（图1-E至图1-J）。

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  图1 ADAM12、MUC3A和MUC17在GC中的表达

  Figure 1.Expressions of ADAM12, MUC3A and MUC17 in GC

  注：A. 根据TCGA数据库中RNA-seq数据绘制出GC差异基因火山图，红色表示上调基因，绿色表示下调基因；B-D. 分别为ADAM12、MUC3A和MUC17与GC的生存预后曲线；E. GC组织与正常胃组织ADAM12表达量之间的比较；F. ADAM12的泛癌表达；G. GC组织与正常胃组织MUC3A表达量之间的比较；H. MUC3A的泛癌表达；I. GC组织与正常胃组织MUC17表达量之间的比较；J. MUC17的泛癌表达；*P＜0.05。

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2.2 ADAM12、MUC3A和MUC17在正常组织中的表达

为阐明ADAM12、MUC3A及MUC17的表达是否具有组织特异性，利用HPA数据库信息得出三种基因在正常组织中的RNA表达情况（图2）。结果显示，ADAM12主要表达于胎盘组织，而在其他正常组织中低表达（图2-A），MUC3A在十二指肠、小肠和胆囊等消化道中RNA表达水平相对较高（图2-B），MUC17主要表达于小肠和十二指肠（图2-C）。

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  图2 ADAM12、MUC3A和MUC17在正常组织中的表达

  Figure 2.Expressions of ADAM12, MUC3A and MUC17 in normal tissues

  注：A. 正常组织中ADAM12的RNA表达；B. 正常组织中MUC3A的RNA表达；C. 正常组织中MUC17的RNA表达。

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2.3 ADAM12、MUC3A和MUC17在GC中的GO与KEGG功能富集分析

GO功能分析结果显示，ADAM12、MUC3A和MUC17对免疫、代谢相关的BP、CC和MF均有影响（图3-A至图3-I）。KEGG功能富集分析结果表明，三种基因均参与了多种生物代谢过程、细胞黏附及信号通路激活（图3-J、图3-K、图3-L），其中，ADAM12显著富集在蛋白质代谢、黏着斑的形成、细胞外基质（extracellular matrix，ECM）-受体相互作用及PI3K-Akt信号通路等，MUC3A和MUC17则主要涉及黏蛋白O-糖基化以及多种生物合成代谢过程。

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  图3 ADAM12、MUC3A和MUC17在GC中的GO与KEGG功能富集分析

  Figure 3.GO and KEGG functional enrichment analyses of ADAM12, MUC3A and MUC17 in GC

  注：A-C. 分别为ADAM12的BP、CC及MF气泡图；D-F. 分别为MUC3A的BP、CC及MF气泡图；G-I. 分别为MUC17的BP、CC及MF气泡图；J. ADAM12通路富集分析气泡图；K. MUC3A通路富集分析气泡图；L. MUC17通路富集分析气泡图。

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2.4 ADAM12、MUC3A和MUC17表达量与不同临床病理特征的相关性

ADAM12、MUC3A和MUC17在GC样本中的表达量与性别、年龄、分期、分级和幽门螺旋杆菌（helicobacter pylori，HP）感染等临床病理特征的关系见表2，结果显示，ADAM12的表达与HP感染存在相关性，GC伴有HP感染的患者中ADAM12的表达量更高；MUC3A的表达主要与年龄、肿瘤组织学分级有关，G1、G2级和60岁以上的GC患者中MUC3A的表达量更高；另外，MUC17的表达与肿瘤T分期存在相关性。

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  表格2 GC患者ADAM12、MUC3A和MUC17的表达量与临床病理特征的相关性（n, %）

  Table 2.Correlation between ADAM12, MUC3A and MUC17 expressions and clinicopathological features in GC patients (n, %)

  注：*P＜0.05，**P＜0.01。

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2.5 ADAM12、MUC3A和MUC17在GC组织与癌旁组织中mRNA的表达

为进一步阐明ADAM12、MUC3A和MUC17在GC中的表达，采用q-PCR验证三种基因在GC肿瘤组织和癌旁组织中的mRNA水平表达差异，结果显示，肿瘤组织中三种基因的mRNA表达水平均明显高于癌旁组织，差异具有统计学意义（P＜0.05）（图4-A、图4-B、图4-C）。

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  图4 ADAM12、MUC3A和MUC17在GC组织中表达上调

  Figure 4.Upregulation of ADAM12, MUC3A and MUC17 expressions in GC tissues

  注：A. q-PCR分析ADAM12在癌旁组织（NC）与GC组织（CA）中的表达；B. MUC3A在癌旁组织与GC组织中的表达；C. MUC17在癌旁组织与GC组织中的表达；*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001。

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3 讨论

GC是我国常见恶性肿瘤之一，由于缺乏明显的临床指征，多数患者以晚期为主，预后不佳[11]。随着免疫治疗和靶向治疗的发展，嵌合抗原受体T细胞疗法（chimeric antigen receptor T-cell immunotherapy，CAR-T）、抗体偶联药物（antibody-drug conjugates，ADC）及双特异性抗体（bispecifc antibodies，BsAbs）药物的出现，给GC的临床治疗带来了新的希望[12-15]。

去整合素金属蛋白酶家族（a disintergin and metalloproteases，ADAMs）是一类I型跨膜和分泌蛋白家族[16]。ADAM12作为ADAMs家族的一员，具有黏附作用和蛋白酶活性[17]。ADAM12分为跨模型（ADAM12-L）和分泌型（ADAM12-S）两种亚型，均参与了恶性肿瘤的生物学行为[18]。有研究表明，ADAM12通过催化或结合靶蛋白参与信号转导、细胞骨架解聚和微环境调控等多种生物学过程，在重塑肿瘤微环境、促进肿瘤细胞增殖和转移方面发挥着重要作用[19-22]。本研究探讨了ADAM12在GC中的表达水平及生存预后分析，发现其在正常组织中显著低表达（除胎盘组织），在GC中的表达明显增高，预示不良的生存结局。此外，慢性HP感染已被证实为非心源性GC的主要病因[1]。本研究发现ADAM12的表达与HP感染存在相关性，伴HP感染的肿瘤患者ADAM12的表达量更高。GO和KEGG功能富集分析发现，在GC中，ADAM12显著富集在蛋白质代谢、黏着斑的形成、ECM-受体相互作用和PI3K-Akt信号通路等，进而促进GC的生长和浸润。黏蛋白家族（mucins，MUCs）是一类分子量较大的糖基化蛋白家族，其广泛存在于正常机体的黏膜表面，在保护上皮、信号转导和调节免疫系统方面发挥着重要作用，也可参与多种疾病的发生发展[23-24]。有研究发现，MUCs可以参与细胞凋亡调控及免疫抗原提呈，促进肿瘤细胞的增殖及转移[25]。MUC3A作为MUC3的亚型，是一种膜结合黏蛋白。研究表明，MUC3A可通过参与磷脂酰肌醇3-激酶（phosphoinositide 3-kinase，PI3K）/蛋白激酶B（protein kinase B，Akt）/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）信号通路的激活，从而促进结直肠肿瘤的进展[26]。此外，MUC3A在非小细胞肺癌中上调，并可以促进肿瘤细胞DNA损伤修复和诱导肿瘤血管生成，导致侵袭性发病机制和不良预后[27-28]。本研究根据生物信息学分析结果和基础实验相互验证发现，MUC3A在GC中的表达量显著高于邻近正常胃组织，且G1、G2分级和60岁以上患者中MUC3A的表达量更高。MUC17作为一种跨膜黏蛋白，主要在消化道中表达，并可保护上皮细胞免受有害物质损伤[29-30]。MUC17可能与癌症的发病机制有关，已被证实在细胞黏附和迁移中发挥重要作用[31-32]。有研究发现，MUC17基因在复发性肺腺癌中发生了显著突变，并参与表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor，ErbB）通路、丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinases，MAPK）通路和细胞周期通路的激活[33]。另外，MUC17可作为监测非小细胞肺癌表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂（epidermal growth factor receptor-tyrosine kinase inhibitors，EGFR-TKIs）耐药性的生物标志物[34]。本研究发现，与正常胃组织相比，MUC17在GC中的表达量更高，并与肿瘤T分期有关。此外，MUC3A和MUC17主要涉及黏蛋白O-糖基化及多种生物合成和代谢过程。其中，O-糖基化是MUC常见的翻译后修饰之一，异常的糖基化与恶性肿瘤的发生发展、转移、浸润、免疫逃逸及耐药密切相关[35]。

综上所述，ADAM12、MUC3A和MUC17在GC中表达上调，且ADAM12与GC预后呈负相关关系，尽管MUC3A、MUC17与患者的OS无相关性，但二者的表达分别与肿瘤分级或分期有关；另外，三种基因在正常组织中表达量低，且在GC的进展中均发挥着重要作用。因此，ADAM12、MUC3A和MUC17或可为今后GC的精确靶向治疗和预后监测提供参考。

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